先天性小耳畸形残耳软骨细胞诱导脂肪来源的干细胞软骨形成的初步研究

论文摘要

第一部分残耳软骨细胞与脂肪来源的干细胞的分离培养与生物学特性研究目的探讨研究先天性小耳畸形残耳软骨细胞与ADSCs的体外生长的生物学特性及其作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法取先天性小耳畸形患者外耳再造手术中废弃的残耳软骨组织与脂肪组织,胶原酶消化法获得残耳软骨细胞与ADSCs,体外传代培养及生物学特性研究:细胞形态学观察,细胞生长曲线测定,Ⅱ型胶原免疫组化鉴定残耳软骨细胞,RT-PCR检测第1～5代残耳软骨细胞的Ⅱ型胶原及蛋白多糖的mRNA表达,免疫组化及流式细胞仪检测ADSCs的细胞表型,及其向软骨、骨、脂肪及内皮多向分化诱导能力检测。结果原代和第1～3代残耳软骨细胞生长旺盛,呈多角形,第3代以后细胞体积变大,呈长梭形转化,细胞增殖逐渐减弱;免疫组化检测2代残耳软骨细胞Ⅱ型胶原表达阳性;RT-PCR显示mRNA水平第1～3代软骨细胞Ⅱ型胶原高表达,随传代次数增加表达逐渐减弱,第5代基本消失;第1～3代细胞蛋白多糖高表达,4代以后随传代表达逐渐减弱。ADSCs生长旺盛,呈成纤维细胞样生长,15代以内细胞形态未见明显变化;免疫组化染色显示:CD29,CD44,CD105表达阳性,CD34,CD45表达阴性;流式细胞仪检测显示:CD29,CD44,CD105,MHC-Ⅰ为阳性,CD3,CD14,CD19,CD31,CD33,CD34,CD45,CD106,CD117,CD184为阴性;成骨诱导von Kossa染色显示钙化基质沉积表达;成脂肪诱导油红-O染色阳性,胞浆内见脂滴形成;成内皮诱导显示细胞之间相互连接聚集成网格样结构,免疫荧光显示CD34表达阳性;成软骨诱导细胞聚集成型趴?Alcian Blue染色显示硫酸蛋白聚糖表达阳性。结论体外成功分离培养出残耳软骨细胞,第1～3代细胞形态保持稳定,Ⅱ型胶原和蛋白聚糖稳定高表达,可作为组织工程耳廓软骨支架构建的种子细胞。ADSCs体外生长能力旺盛,高表达干细胞相关抗原,可长期传代,具有向软骨,骨,脂肪,内皮多向分化潜能,可作为组织工程软骨构建的种子细胞。第二部分残耳软骨细胞诱导脂肪来源的干细胞体内软骨形成实验研究目的探讨残耳软骨细胞能否在裸鼠体内非软骨环境下模拟软骨诱导微环境,促进ADSCs向软骨分化并形成组织工程软骨。方法实验分组:第2代残耳软骨细胞与第3代ADSCs以3:7比例混合作为实验组（Exp）,单纯残耳软骨细胞作为阳性对照组（Ctrl.1）,单纯ADSCs作为阴性对照组（Ctrl.2）,Exp、Ctrl.1和Ctrl.2组接种细胞终浓度为5.0×107/ml,单纯低密度残耳软骨细胞对照组（Ctrl.3）细胞终浓度为1.5×107/ml。按照实验分组将0.2ml细胞—Pluronic-F127复合物注射到裸鼠背部皮下,体内培养8周后对新生组织的大体观察、湿重比较、糖胺多糖含量测定、组织学及免疫组化染色检测。结果Exp组与Ctrl.1组注射部位均有白色半透明状类似软骨组织形成,其外观和弹性与正常软骨极为相似;Ctrl.2组形成了质软的纤维样组织,色淡黄色;Ctrl.3组大部分标本生成了类似软骨组织,但表面光泽度及弹性差。Exp组平均湿重达到Ctrl.1组的80%以上:Ctrl.3组平均湿重低于Ctrl.1组平均湿重的30%;Exp组平均GAG含量达到Ctrl.1组的90%以上;Exp组和Ctrl.1组的平均湿重和GAG平均含量均显著高于Ctrl.2组和Ctrl.3组（P＜0.05）。组织学染色:Exp组、Ctrl.1组与Ctrl.3组标本均有成熟的软骨陷窝形成,Ctrl.3组与Exp与Ctrl.1组相比较,软骨陷窝松散排列不均,胞外基质着色淡;Ctrl.2组为纤维样组织,未见软骨陷窝形成。Ⅱ型胶原免疫组化染色:Exp、Ctrl.1与Ctrl.3组可见成熟软骨陷窝周围有不同程度的棕黄色沉淀即Ⅱ型胶原表达;Ctrl.2组未见Ⅱ型胶原表达。结论残耳软骨细胞能够在裸鼠体内非软骨环境下模拟软骨诱导微环境,促进ADSCs向软骨分化并生成组织工程软骨。第三部分残耳软骨细胞诱导脂肪来源的干细胞体外软骨形成实验研究目的探讨残耳软骨细胞能否在体外模拟软骨诱导微环境,促进ADSCs向软骨分化并形成组织工程软骨。方法实验分组:第2代残耳软骨细胞与第3代ADSCs以3:7比例混合作为实验组（Exp）,单纯残耳软骨细胞作为阳性对照组（Ctrl.1）,单纯ADSCs作为阴性对照组（Ctrl.2）;分别取Exp组、Ctrl.1组和Ctrl.2组细胞各1.0×106个,离心获得细胞沉淀Pellet,体外离心管培养4周,观察各组细胞Pellet在体外培养过程中及取材时大小、形状、质地、色泽的变化及各组湿重与GAG平均含量之间的差别;RT-PCR检测各组Pellet标本的Ⅱ型胶原、Aggrecan的mRNA表达;组织学及免疫组化检测。结果体外培养3天时,各组细胞均聚集成团,形成近似圆形组织块,沉于管底。4周后取材见,Exp组与Ctrl.1组标本形成圆盘状组织块,白色半透明,表面光滑,弹性可;Ctrl.2组标本组织块有明显收缩,呈黄色球状,无弹性。Exp组平均湿重达到Ctrl.1组的80%以上,Exp组平均湿重显著高于Ctrl.2组（P＜0.05）;Exp组的GAG平均含量达到了Ctrl.1组的80%以上,Ctrl.2组的GAG平均含量均显著低于Exp组和Ctrl.1组（P＜0.01）。RT-PCR结果显示Exp组与Ctrl.1组Pellet有Ⅱ型胶原与Aggrecan的mRNA表达,Ctrl.2组未见其表达。Exp组与Ctrl.1组Pellet标本HE染色可见形成了大量的软骨陷窝样结构,甲苯胺蓝染色见胞外基质均有不同程度的蓝染,Safranin O染色见胞外基质不同程度的红染;Ctrl.2组Pellet标本的组织内主要为纤维性成分,未见软骨陷窝,基质染色阴性。Ⅱ型胶原免疫组化染色:Exp组、Ctrl.1组可见在软骨陷窝周围有不同程度棕黄色沉淀即Ⅱ型胶原表达;Ctrl.2组未见表达。结论残耳软骨细胞在体外独立模拟软骨诱导微环境,促进ADSCs软骨定向分化并形成软骨组织。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 残耳软骨细胞与脂肪来源的干细胞的分离培养与生物学特性研究
• 前言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 残耳软骨细胞诱导脂肪来源的干细胞体内软骨形成实验研究
• 前言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 残耳软骨细胞诱导脂肪来源的干细胞体外软骨形成实验研究
• 前言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 文献综述
• 致谢