论文摘要
蛋白酶激活受体（protease/proteinase-activated receptors, PARs）属于与G蛋白相偶联、有七个跨膜单位的受体家族[1],目前在人和小鼠中共发现4种PARs,分别为PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4。其中PAR-1, PAR-3和PAR-4是凝血酶受体[2,3,4],PAR-1, PAR-2和PAR-4是胰蛋白酶受体,PAR-2是类胰蛋白酶受体。RNA干扰（RNA interference,RNAi ）是是指细胞产生内源性双链RNA（double stranded RNA,dsRNA ）或导入外源性dsRNA后,与dsRNA同源的内源性mRNA发生特异性的降解,从而导致基因表达沉默的现象。因这种现象发生在转录后水平,故又称为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS ）[5]。这种RNA水平上的基因抑制,提供了一种特异性失活功能基因的方法,成为基因表达调控和功能基因组学研究的一个重要手段。本研究通过RNA干扰技术,抑制PAR-1、PAR-2和PAR-4基因的表达,并探讨了PARs基因与IL-4、IL-6和IL-13分泌的影响。分别合成了含有21个核苷酸PAR-1, PAR-2和PAR-4的的小双链干扰RNA（siRNA）,每种基因合成3对siRNA（siRNA PAR1-1、siRNA PAR1-2和siRNA PAR1-3;siRNA PAR2-1、siRNA PAR2-2和siRNA PAR2-3;siRNA PAR4-1、siRNA PAR4-2和siRNA PAR4-3）。利用RNA干扰技术,将以上9种siRNA分别导入P815细胞中。通过实时定量PCR、Western Blot免疫印记检测技术、流式细胞术和激光共聚焦技术在mRNA水平和蛋白水平分别检测PAR-1,PAR-2和PAR-4表达情况;用PARs的激动肽、胰蛋白酶、类胰蛋白酶和凝血酶分别激发干扰了PAR-1、PAR-2和PAR-4表达40小时后的P815细胞16小时,用ELISA检测P815细胞细胞培养上清液中的IL-4、IL-6和IL-13。实验结果显示:3种PAR-1的siRNA中,siRNA PAR1-1对目的基因无明显抑制作用;PAR1-2在浓度为3nm,转染48小时时的抑制效果最强,siRNA PAR1-3有较弱的抑制作用;3种PAR-2的siRNA中,PAR2-1、PAR2-2、PAR2-3对目的基因均有一定的抑制作,其中siRNA PAR2-3对PAR2的抑制作用最强,其次为siRNA PAR2-2;3种PAR-4的siRNA中,siRNA PAR4-3在转染不同的时间对PAR4均有较稳定的抑制作用,其中在转染48小时时,对PAR4的抑制作用最强,且较低浓度的siRNA抑制作用更强。siRNA PAR4-1和PAR4-2对目的基因的抑制作用较弱。PAR-2和PAR-4不直接参与IL-4、IL-6和IL-13的释放;PAR-1也不参与IL-4和IL-13的释放;PAR-1被抑制时,IL-6的释放量增加,暗示存在某种途径可以通过PAR-1来抑制IL-6的释放。在mRNA水平上沉默PAR-1、PAR-2和PAR-4的表达后,胰蛋白酶和类胰蛋白酶将不再能促进IL-4的分泌,说明胰蛋白酶和类胰蛋白酶对肥大细胞P815的作用极可能通过激活PARs实现。而凝血酶对肥大细胞P815的作用有可能是通过激活PAR-1和PAR-4实现的。当P815细胞中的PAR-1的表达被抑制时,Il-6的释放增加,提示PAR-1可能通过某种途径参与了IL-6的释放。凝血酶、胰蛋白酶和类胰蛋白酶引起的IL-6的产生至少有部分途径是通过PAR-1和PAR-2而起作用。PAR-4参与了这些丝氨酸蛋白酶引起的IL-6的释放,并且这种作用具有放大效应,故当PAR-4被抑制时,P815细胞的IL-6的释放与对照相比会明显减少。在mRNA水平上沉默PAR-1、PAR-2和PAR-4的表达后,PAR-AP、凝血酶、胰蛋白酶和类胰蛋白酶将不再能促进P815细胞内IL-13的分泌,说明PAR-1、PAR-2和PAR-4可能部分的参与了IL-13的分泌释放。