促胚胎干细胞生长的中草药提取物高通量筛选方法的构建及初步应用研究

论文摘要

胚胎干细胞（ESC）能无限增殖，具有可以分化成各种细胞和组织的能力，是在组织工程和细胞治疗中理想的细胞资源。尽管在许多研究工作中，开发出了具有生物相容性的培养基质和适合细胞生长的生物反应器，用于体外干细胞的培养和维持，但是昂贵的细胞生长因子和多能性维持试剂依然使得对ESC进行大量生产是十分困难和具有挑战的。如今，传统中草药（TCHM）由于自身对疾病的治疗效果和对细胞毒性作用低等原因，开始得到了广泛关注。除了疾病治疗外，一些草药还可以通过激活淋巴细胞、增加自然杀伤细胞和抗氧化等方式提高机体免疫力，因此，TCHM也成为了拥有潜在促进ESC增殖能力的新型药物资源。本研究建立了一种简单、高效、可靠和高通量的筛选方法，用于评估TCHM提取物对细胞生长的作用效果。这一筛选平台建立在聚对苯二甲酸乙二酯（PET）为支架进行三维（3D）细胞培养的基础之上，选用转染后稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠ESC、人乳腺癌和结肠癌细胞系，并采用改良的384荧光孔板对细胞表达的荧光强度进行在线监测，从而对细胞生长动力学进行实时分析，实现动态反映药物对细胞生长影响的效果。通过检测不同浓度下脱氧胆酸、灵芝孢子粉（Gls）、银杏和淫羊藿的水提取物对细胞增殖和细胞毒性的作用，得到的检测结果与已有相关报道中的结果一致。在可靠性分析中，Z检验结果为0.5和1.0之间，证明这种细胞水平药物筛选（CBDS）平台提供的筛选结果变异性小，适合用于TCHM的高通量筛选（HTS）。Gls浓度为0.01%（w/v）时，mESC在旋转瓶中3D动态培养5d后扩增倍数为18.5，与没有添加药物的对照组（扩增13.6倍）相比，扩增倍数提高了36.1%，同时mESC对SSEA-1和Oct-4的表达维持在90%以上。分别将水溶性的灵芝多糖（PSS）和脂溶性的灵芝三萜（TTS）进行分离和提取，并在3D荧光CBDS系统中检测这两种有效成分对mESC细胞的影响，结果显示当PSS和TTS单独作用于mESC细胞时，没有增殖促进效果。对另外6种TCHM在ESC生长中的作用进行了考察，发现三七（Pn）、白术（Ram）、川芎（Rc）和Gls表现出促进ESC增殖的潜力。对这4种药物搭配成的11种药物组合继续进一步筛选，结果显示将Pn和Gls等量混合后，提取物（Pn/Gls）对ESC生长的促进效果十分明显，与没有药物处理的细胞相比，Pn/Gls在较低的剂量下（0.01%w/v）使ESC的比生长速率提高了29.5%（p <0.01），在较高剂量（0.1%w/v）时也使比生长速率增加了34.2%（p <0.05）。之后在旋转瓶反应器中对Pn/Gls在大规模培养环境中促进细胞生长的效果进行验证，5天培养结束后，添加0.01%Pn/Gls的培养基中生长的ESC扩增倍数达到了29.3，而对照组扩增倍数为16.8。此外，在Pn/Gls作用下生长的ESC，生长速率提高的同时对全能性基因阶段特异性胚胎抗原（SSEA-1）和Oct-4基因的表达水平并没有下降，而且细胞核型也没有受到破坏。因此，这种3D荧光细胞水平的筛选方法能够提供高效、可靠的方式，从TCHM中筛选ESC生长促进因子；而通过这种筛选体系得到的药物Pn/Gls在大规模生产高质量ESC的应用当中也具有很好的前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 主要英文缩略词表
• 第一章 绪论
• 1.1 ESC 体外大规模扩增与 TCHM 的潜在作用
• 1.1.1 细胞治疗对 ESC 的需求
• 1.1.2 TCHM 对促进细胞生长的潜在作用
• 1.2 体外 ESC 的培养体系
• 1.2.1 饲养层细胞培养体系
• 1.2.2 条件培养基无饲养层体系
• 1.2.3 确定成分培养基体系
• 1.3 体外 ESC 的培养方式
• 1.3.1 ECM 涂层
• 1.3.2 微载体培养
• 1.3.3 悬浮培养
• 1.4 支架材料与生物反应器
• 1.4.1 支架材料的选择
• 1.4.2 生物反应器大规模培养
• 1.4.3 剪切力对反应器中细胞的影响
• 1.5 新的 ESC 生长促进因子
• 1.5.1 药物筛选方法的选择
• 1.5.2 TCHM 的特点
• 1.6 CBDS 方法
• 1.6.1 CBDS 的特点
• 1.6.2 实现 HTS 的常用 CBDS 方法
• 1.6.3 电化学检测法
• 1.6.4 光学检测法
• 1.7 TCHM 和药用天然产物筛选方法
• 1.7.1 TCHM 筛选模型
• 1.7.2 整体动物模型用于 TCHM 筛选
• 1.7.3 分子水平高通量 TCHM 筛选
• 1.7.4 细胞水平高通量 TCHM 筛选
• 1.8 以 GFP 为基础的细胞水平 HTS 在 TCHM 评估中的应用
• 1.9 本研究的意义及技术路线
• 第二章 用于 TCHM 筛选的 CBDS 平台建立
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 细胞系与材料
• 2.1.2 药品与试剂
• 2.1.3 仪器与设备
• 2.1.4 候选 TCHM
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 TCHM 提取物制备
• 2.2.2 GFP 细胞系建立与细胞培养
• 2.2.3 3D 荧光 HTS 体系
• 2.2.4 扫描电镜观察材料中细胞形态
• 2.2.5 数据分析方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 CBDS 方法检测 DCA 对细胞生长的影响
• 2.3.2 Gls 对细胞生长的作用
• 2.3.3 Gb 对细胞生长的作用
• 2.3.4 Eb 对细胞生长的作用
• 2.3.5 CBDS 方法的筛选结果与优势分析
• 2.3.6 CDBS 平台可靠性分析
• 2.4 本章小结
• 第三章 GLS 对细胞生长的影响
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 细胞系
• 3.1.2 药品与试剂
• 3.1.3 仪器与设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 细胞 2D 环境下生长检测
• 3.2.2 3D 静态和动态 mESC 扩增
• 3.2.3 Gls 有效成分提取
• 3.2.4 数据分析
• 3.2.5 细胞周期检测
• 3.2.6 FACS 对 mESC 表面标记检测
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 Gls 对 2D 培养细胞的影响
• 3.3.2 Gls 在 mESC 扩增中的作用
• 3.3.3 PSS 和 TTS 对 mESC 的影响
• 3.3.4 Gls 对细胞周期的影响
• 3.4 本章小结
• 第四章 CBDS 平台筛选促 MESC 增殖的 TCHM
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 细胞系
• 4.1.2 药品与试剂
• 4.1.3 仪器与设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 TCHM 提取物制备
• 4.2.2 细胞培养方法
• 4.2.3 3D 培养筛选 TCHM
• 4.2.4 旋转瓶扩增培养
• 4.2.5 FACS 对 mESC 表面标记检测
• 4.2.6 检测与分析方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 3D 荧光 CBDS 体系对 TCHM 筛选结果
• 4.3.2 组合 TCHM 对 mESC 生长的影响
• 4.3.3 Pn/Gls 对 mESC 细胞 3D 培养的影响
• 4.4 本章小结
• 第五章 TCHM 组合 PN/GLS 对 MESC 生长的影响
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 细胞系
• 5.1.2 药品与试剂
• 5.1.3 仪器与设备
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 旋转瓶扩增 mESC
• 5.2.2 细胞核型分析
• 5.2.3 免疫荧光染色
• 5.2.4 细胞周期检测
• 5.2.5 快速 MTT 法检测细胞增殖
• 5.2.6 HPLC 检测活性成分
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 旋转瓶中 mESC 扩增
• 5.3.2 药物 Pn/Gls 对 mESC 的影响
• 5.3.3 血清饥饿胁迫下 Pn/Gls 对 mESC 抗凋亡的影响
• 5.3.4 人参皂苷 Rg1 对 mESC 增殖的影响
• 5.4 本章小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附件