ADAM10参与垂体腺瘤海绵窦侵袭性行为的实验研究

论文摘要

背景垂体腺瘤在人群中的年发病率8.2/10万-14.7/10万,占原发性颅内肿瘤的10%-15%,是严重危害人类身心健康的疾病。垂体腺瘤的发生和生物学行为与一般意义上的癌症有着明显区别,肿瘤体积大小及侵袭性并不是完全反映细胞增殖及肿瘤生长速度的,有关细胞增殖、细胞周期、细胞死亡及分化等肿瘤学常用方面的研究,似乎并不能真正的从垂体瘤这一特定的角度来说明和解决问题,而关于肿瘤侵袭和转移的研究,恰如其分的成为垂体瘤目前的研究重点,大量的文献抛弃了肿瘤发生学的研究,进而把研究重点转移到了垂体瘤侵袭性发生机制上。这也正是临床治疗垂体腺瘤的难点和重点。目前,侵袭性的诊断还是依靠影像学、组织病理学以及术中的直接观察,组织病理学检查硬膜侵袭受到取材困难的限制,临床应用少,而影像学分析及术中的观察都会有主观因素存在,结果往往会因人而异,重复性、准确性受到限制。因此,目前研究方向主要是寻找垂体腺瘤侵袭性的客观分子标志物。客观分子指标应该具有足够的敏感性,能早期判断肿瘤的侵袭性潜质,能指导临床医生改变手术和药物治疗的策略,更进一步研究,还可能根据侵袭性分子发展抑制剂,为未来的药物治疗和基因治疗奠定基础。ADAMs（A disintegrin and metalloproteinases）是一个新的基因家族,含有解聚素域,并与基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）共享“金属蛋白酶域”。从结构上分为两类:膜锚的ADAM和分泌性的含有凝血酶敏感蛋白的ADAM-TS（ADAM with thrombospondin motifs）。这些分子在细胞粘附、细胞融合、细胞迁移、膜蛋白脱落和分解等生物学行为中起作用。很多研究提示ADAMs在恶性肿瘤中表达,在癌症中参与病理过程。ADAM10是ADAMs家族成员,在多种肿瘤中有过表达现象,通过与多种癌症发生发展中关键的信号分子,包括ErbB,Notch和数种粘附分子等相互作用,在炎症及肿瘤中起重要作用。典型的ADAM蛋白包括N-末端信号序列、前结构域、金属蛋白酶域、解聚素域、富半胱氨酸域、跨膜域和胞内域。ADAM10蛋白活化后锚固在细胞膜表面,水解各种炎症和肿瘤的底物,参与致病过程,其底物包括黏附分子L1和CD44。CD44是Ⅰ型跨膜细胞表面黏附分子,参与肿瘤侵袭和转移。其在多数人类细胞中有表达,而高水平的CD44表达可在多种癌症中检测到。CD44蛋白获得功能的关键步骤依赖于其胞外域的裂解,此过程是由ADAM10调节的,产生大量的可溶性CD44,随后导致细胞粘附下降,可能促使细胞从胞外基质中分离,是肿瘤细胞迁移的重要步骤。L1黏附分子是ADAM10的另一种底物,是免疫球蛋白家族中的Ⅰ型跨膜糖蛋白,通过调节细胞粘附和迁移,对神经系统发育有重要作用。L1过表达在多种肿瘤中被发现,并且与肿瘤的侵袭性和转移性增强相关。本课题利用免疫组化、实时荧光定量PCR、Western blot等检测技术首先在大体标本及GH3细胞株中验证ADAM10的表达,并分析蛋白水平与肿瘤侵袭性的关系;在细胞系中初步研究ADAM10蛋白裂解底物的分子机制;并采用RNA干扰及过表达等基因工程技术,在GH3细胞株中进行ADAM10基因的功能研究,探讨ADAM10参与垂体瘤海绵窦侵袭的作用和机制,预测其成为垂体瘤侵袭性分子标志物,为临床决策提供指导,为基因治疗开辟新方向。第一部分:ADAM10在垂体腺瘤组织中的表达及意义目的:明确ADAM10及其底物CD44、L1在侵袭性腺瘤和非侵袭性腺瘤中的表达水平;研究侵袭性腺瘤和非侵袭性腺瘤组间CaM-ProADAM10、Src-Shc相互作用的差别;分析ADAM10的表达与临床资料相关性。方法:肿瘤组织标本按照Knosp分级分为侵袭性组和非侵袭性组,根据临床特征和内分泌水平分为功能性腺瘤组（GH腺瘤、PRL腺瘤）、无功能腺瘤组。实时荧光定量PCR检测ADAM10转录水平;免疫组化检测肿瘤中ADAM10、Src、ERK定位及表达水平;Western blot检测ADAM10、L1、CD44、E-cadhein/Vimentin等蛋白的表达水平;免疫共沉淀研究CaM-ProADAM10相互作用及Src-Shc相互作用。比较组间差异。结果:1.侵袭性腺瘤组ADAM10在mRNA水平和蛋白水平均高表达于非侵袭性组;2. ADAM10蛋白表达于细胞膜;ADAM10蛋白差异染色与肿瘤的侵袭性相关,而与年龄、性别、分泌功能不相关;p-Src及p-ERK的染色差异均与ADAM10表达相关,有统计学意义,p值分别为0.036、0.035;3.底物分子CD44、L1蛋白裂解水平在侵袭性腺瘤组均高于非侵袭性组,p<0.05;4.免疫共沉淀显示侵袭性腺瘤组与非侵袭性腺瘤组比较CaM-ProADAM10结合减弱,Src-Shc作用增强,p<0.05;5.迁移相关的分子标志物E-cadhein在侵袭性组高表达,而Vimentin趋势相反,p<0.05。结论:1. ADAM10高表达和垂体腺瘤海绵窦侵袭性相关;2. ADAM10可能通过裂解L1和CD44黏附分子,增强细胞迁移能力,实现肿瘤细胞的侵袭性;3.在侵袭性垂体瘤中ADAM10活化可能是由CaM-ProADAM10结合减弱引起的;4. ADAM10裂解底物功能的实现可能与Src/Shc作用加强而进一步激活ERK通路相关。第二部分:ADAM10在垂体瘤细胞株GH3中的表达研究及作用机制的初步探讨目的:研究ADAM10蛋白及其底物L1和CD44分子在GH3细胞株中表达情况;研究上调Ca2+内流及阻断Ca2+内流对ADAM10活化的影响;研究上调Ca2+内流情况下CaM-ProADAM10的相互作用变化、对CD44分子裂解程度的影响;研究PMA处理对L1裂解的影响、Src磷酸化的变化、Src-Shc相互作用的变化;最后通过激光共聚焦实验直观的观察Ca2+内流对CD44分子裂解的影响,以及PMA处理对L1裂解的影响。方法:GH3细胞株中ADAM10、L1和CD44的蛋白表达情况采用Western blot方法检测;增加Ca2+内流方法采用Mechanical Scraping技术和添加离子霉素的方法,分为2组;Ca2+内流的阻断采用EGTA阻断,在0min、15min、30min分别收集细胞进行检测;Co-IP检测Mechanical Scraping处理后CaM-ProADAM10的相互作用、PMA处理后Src-Shc的相互作用变化;Western blot检测Ca2+内流情况下CD44分子的裂解水平、PMA处理后L1的裂解水平;免疫荧光染色后激光共聚焦检测PMA处理后L1的变化及Ca2+内流后CD44的变化。结果:GH3细胞株中有ADAM10、L1及CD44蛋白的表达;Ca2+内流后活性ADAM10增加,而CaM-ProADAM10作用减弱;Ca2+内流后CD44裂解程度加强;而阻断Ca2+后出现相反的结果。PMA处理后L1裂解程度加强、Src磷酸化程度升高、Src-Shc相互作用加强。激光共聚焦结果直观的观察到L1和ADAM10共定位于细胞膜,PMA处理后L1分子被裂解散在分布;CD44分子与ADAM10共定位于细胞膜,Ca2+内流后ADAM10荧光信号加强,而相应CD44分子裂解增强。结论:1. GH3细胞株中有ADAM10蛋白表达及L1、CD44的裂解,但水平较低;2. Ca2+内流刺激能使CaM释放对ADAM10的抑制作用,而活化ADAM10,进一步裂解CD44分子;3. PMA处理能增强Src-Shc相互作用,激活ERK通路,进一步加强L1的裂解程度。第三部分:过表达及RNA干扰目的基因ADAM10,对GH3细胞株生物学行为的影响研究目的:利用RNA干扰和基因过表达等技术,进行ADAM10的功能研究。方法:RNA干扰内源性ADAM10后:用Western blot检测L1、CD44分子的裂解程度、Src磷酸化程度、ERK通路抑制剂PD阻断ERK后,检测L1裂解程度;激光共聚焦直观观察干扰后L1、CD44裂解情况;慢病毒法过表达ADAM10后:Western blot检测L1裂解程度及Src磷酸化程度;过表达ADAM10后激光共聚焦观察E-cadherin和Vimentin的变化;通过粘附实验,研究RNA干扰后GH3细胞粘附能力的变化;Transwell小室实验研究GH3细胞侵袭性的变化。结果:GH3细胞株中,RNA干扰内源性ADAM10后L1和CD44分子的裂解程度明显下降,再加入ERK抑制剂PD98059能进一步减少L1裂解;而过表达ADAM10后L1裂解程度加强、Src磷酸化程度上升;激光共聚焦观察RNA干扰后L1和CD44分子的裂解明显下降;激光共聚焦观察过表达ADAM10后E-cadherin增加,而Vimentin减少;RNA干扰后GH3细胞粘附能力加强;Transwell小室实验发现RNA干扰后在透明质酸基底膜中,细胞迁移能力明显下降。结论:1.阻断内源性ADAM10后L1、CD44裂解程度下降,上调其表达后黏附分子裂解上升,说明ADAM10参与L1、CD44的裂解;2. Src-ERK通路参与L1的裂解过程;3.敲除ADAM10后,GH3细胞粘附能力增强,侵袭能力下降,说明ADAM10在GH3细胞粘附和迁移过程中起重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 ADAM10 在垂体腺瘤组织中的表达及意义
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 ADAM10 在垂体瘤细胞株中的表达研究及作用机制探讨
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 过表达及RNA 干扰目的基因ADAM10，对GH3 细胞株生物学行为的影响研究
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 综述
• 参考文献
• 博士在读期间发表文章
• 致谢