重组溶菌酶特性及其对小鼠肠道菌群的影响研究

论文摘要

饲料、食品由于其加工工艺、独特风味、防腐保鲜等方面的要求，必须使用相应的添加剂，各种添加剂由于其操作简单、效果显著且成本低廉，已经得到广泛运用，但随着相关研究的深入，传统添加剂可能对人体造成的潜在危害逐渐受到重视，寻找一种稳定、高效、安全性良好的新型添加剂显得十分重要。人源溶菌酶是溶菌酶类物质的一种，广泛存在于人体体液和组织中。通过基因工程技术将编码人源溶菌酶相关基因导入工程细菌通过微生物发酵法得到的溶菌酶称为重组溶菌酶。重组溶菌酶具有广谱抗菌、保鲜防腐、消炎抗病毒等溶菌酶共有特点，整体效果优于蛋清溶菌酶，可替代传统防腐剂，也可作为功能因子添加于饲料、食品中，应用潜质广阔；此外，重组溶菌酶是人体非特异性免疫因子，具有巨大科研价值是研究分子进化、分子免疫关系的良好模型。本课题旨在通过对重组溶菌酶酶学性质，实际防腐保鲜效果及小鼠肠道菌群及血清生化指标调节作用的研究，探寻其作为饲料、食品添加剂使用的实际效果及对机体产生的影响。首先，本文以经典比浊法为基础，在不同温度、pH、人工胃肠液及金属离子条件下，以微球菌为底物，测定蛋清、重组溶菌酶酶活变化状况；然后，用不同浓度的重组溶菌酶溶液浸泡斑点叉尾鮰鱼肉，分别测定不同时期鱼肉感官指标、菌落总数、pH值、TVB-n值、TBA值、酸度；最后，通过小鼠饮水口服溶菌酶（蛋清溶菌酶和重组溶菌酶酶活分别为2500、5000U/ml）后无菌取肠道内容物，通过微生物培养测定肠道菌群的变化；并测定不同试验时间的血清总蛋白、尿素氮、甘油三酯、胆固醇的含量。酶学性质试验结果表明，蛋清溶菌酶最适温度为40℃，最适pH6.0；重组溶菌酶最适温度45℃，最适pH6.0；两种溶菌酶在温度超过50℃后活性迅速下降，但重组溶菌酶酶活下降较快；室温条件下在pH值6.0-9.0溶液中预处理60min，两种溶菌酶活力均保持80%以上；在人工胃液中，两种溶菌酶活性迅速下降；在人工肠液中，重组溶菌酶酶活下降明显较慢；Fe3+、Ca2+、K+、Mn2+、Zn2+、Mg2+、Al3+、Cu2+均会不同程度的抑制两种溶菌酶活性。保鲜试验结构表明，不同浓度重组溶菌酶溶液浸泡后鱼肉感官指标下降速度，挥发性盐基氮、TBA值上升速度，菌落总数和酸度不同程度降低，表明重组溶菌酶能够减缓鱼肉腐败进程，达到延长保藏期、最大限度发挥鱼肉食用价值和商品价值的作用。实际应用中，0.25%重组溶菌酶即可得到较好保鲜效果，将斑点叉尾鮰保藏期由4天延长至12天。动物试验结果表明，两种溶菌酶均能不同程度降低小鼠肠道金黄色葡萄球菌、粪肠球菌数量，促进双歧杆菌、乳酸杆菌生长，但重组溶菌酶对大肠埃希菌群抑制作用明显（P<0.05），蛋清溶菌酶不明显（P>0.05）；不同浓度两种溶菌酶均能一定程度提高血清总蛋白含量，降低尿素氮、胆固醇含量，其中重组溶菌酶（5000U/ml）饲喂21天后血清总蛋白、尿素氮、胆固醇同对照组差异显著（P<0.05）。本课题显示，蛋清、重组溶菌酶均具有调节机体肠道菌群平衡，血清指标的作用，重组溶菌酶的效果更为明显，在实际应用中需要注意温度、pH、胃液肠液、金属离子对酶活的影响，此外重组溶菌酶能够显著延长水产品保藏期，非常适合作为饲料、食品添加剂使用。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 图清单
• 表清单
• 第1章 溶菌酶简介、分类、应用及分离纯化
• 1.1 溶菌酶简介
• 1.2 溶菌酶分类
• 1.2.1 蛋清溶菌酶
• 1.2.2 人源溶菌酶
• 1.2.3 微生物溶菌酶
• 1.2.4 植物溶菌酶
• 1.2.5 动物溶菌酶
• 1.3 溶菌酶在各领域应用的研究进展
• 1.3.1 溶菌酶在食品工业的应用
• 1.3.2 溶菌酶在饲料工业的应用
• 1.3.3 溶菌酶在医药行业的应用
• 1.3.4 溶菌酶在科研行业的应用
• 1.4 本论文研究的目的、意义及主要内容
• 第二章 重组溶菌酶与蛋清溶菌酶酶学性质对比研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与仪器
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 实验材料及试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 溶菌酶酶活力的测定
• 2.3.2 温度对两种溶菌酶酶活性的影响及其热稳定性测定
• 2.3.3 pH 值对两种溶菌酶活性的影响及其酸碱稳定性
• 2.3.4 人工胃液、肠液对两种溶菌酶活性的影响
• 2.3.5 常见金属离子对两种溶菌酶酶活性的影响
• 2.3.6 数据分析
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 温度对两种溶菌酶酶活性的影响及其热稳定性测定
• 2.4.2 pH 值对两种溶菌酶活性的影响及其酸碱稳定性
• 2.4.3 人工胃液、肠液对两种溶菌酶活性的影响
• 2.4.4 常见金属离子对两种溶菌酶酶活性的影响
• 2.5 分析与讨论
• 2.6 小结
• 第三章 重组溶菌酶对斑点叉尾鮰鱼肉保鲜效果的研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与仪器
• 3.2.1 实验仪器
• 3.2.2 实验材料及试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 样品制备
• 3.3.2 鱼肉感官评定
• 3.3.3 鱼肉菌落总数的测定
• 3.3.4 鱼肉 pH 值的测定
• 3.3.5 鱼肉挥发性盐基氮的测定
• 3.3.6 鱼肉酸度的测定
• 3.3.7 鱼肉油脂 TBA 值的测定
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 鱼肉感官评测
• 3.4.2 鱼肉菌落总数的测定
• 3.4.3 鱼肉 pH 值的测定
• 3.4.4 鱼肉挥发性盐基氮的测定
• 3.4.5 鱼肉酸度的测定
• 3.5 讨论与结论
• 第四章 重组溶菌酶与蛋清溶菌酶对小鼠肠道菌群和血清生化条件的影响
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料与仪器
• 4.2.1 实验仪器
• 4.2.2 实验材料及试剂
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 动物实验设计及给药
• 4.3.2 血清取样
• 4.3.3 肠道菌群分析
• 4.3.4 数据分析
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 重组溶菌酶与蛋清溶菌酶对小鼠肠道菌群的影响
• 4.4.2 重组溶菌酶与蛋清溶菌酶对小鼠部分血清生化指标的影响
• 4.5 分析与讨论
• 4.6 小结
• 全文总结
• 研究创新点与展望
• 参考文献