短杆菌胆固醇氧化酶基因的表达研究

论文摘要

胆固醇氧化酶（EC1.1.3.6 COD）在食品加工、医疗检测、生物抗虫等方面的作用日益受到人们的重视,并且显示出巨大的应用潜力。本文主要研究短杆菌Brevibacterium sp. DGCDC-82胆固醇氧化酶在大肠杆菌和在巴斯德毕赤酵母中的表达。用PCR方法从Brevibacterium sp. DGCDC-82染色体DNA中扩增出含信号肽序列的胆固醇氧化酶结构基因,插入大肠杆菌表达载体pET28a（+）中,构建成重组质粒pET28a-COD（s+）。以pET28a-COD（s+）为底物,扩增出不含信号肽的胆固醇氧化酶结构基因,构建成重组质粒pET28a-COD（s-）。两种重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3）均获得活性表达,不含信号肽基因的转化子酶活较高。在转化子中,两种结构基因与pET28a（+）携带的His-tag融合表达,经IPTG诱导后均表达出分子量约为55kD的蛋白质,目的蛋白大都为没有活性的包涵体,占细胞总蛋白的50%以上。将不含信号肽的胆固醇氧化酶基因克隆至含trp/lac双启动子的表达载体pTrc99a中,并在大肠杆菌JM109中进行了IPTG诱导表达,并分别考察了诱导温度、时间、IPTG浓度等因素对重组菌表达的胆固醇氧化酶的影响。在优化条件下,该胆固醇氧化酶的酶活可以达到700 U/L。酶学特性分析表明其反应的最适pH为7.5,最适温度为40℃。将不含信号肽的胆固醇氧化酶结构基因插入巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的EcoR I和Not I位点,构建成pPIC9K-COD,重组质粒以Sac I线性化后电转化巴斯德毕赤酵母GS115。甲醇诱导条件下,重组胆固醇氧化酶仅有少量存在于细胞破碎液的上清液中,并没有在毕赤酵母中获得分泌表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 胆固醇氧化酶的来源和分类
• 1.2 胆固醇氧化酶分子研究进展
• 1.2.1 胆固醇氧化酶的酶学性质
• 1.2.2 胆固醇氧化酶的结构和反应机理
• 1.2.3 胆固醇氧化酶酶活的测定
• 1.2.4 胆固醇氧化酶的基因克隆和表达研究
• 1.3 胆固醇氧化酶应用前景
• 1.3.1 临床诊断
• 1.3.2 食品加工
• 1.3.3 制药工业
• 1.3.4 工具酶
• 1.3.5 新型杀虫剂
• 1.4 立题背景及本文的主要研究内容
• 第二章 信号肽对BREVIBACTERIUM SP. DGCDC-82 胆固醇氧化酶基因在E.C OLI 中表达的影响
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 工具酶和试剂
• 2.1.3 培养基及常用试剂的配制
• 2.1.4 引物
• 2.1.5 主要实验仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 胆固醇氧化酶基因组DNA 的提取
• 2.2.2 胆固醇氧化酶基因的扩增
• 2.2.3 DNA 电泳回收（参照回收试剂盒）
• 2.2.4 质粒的提取
• 2.2.5 DNA 的限制性酶切
• 2.2.6 质粒载体片段与外源片段的连接
• 2 法制备感受态细胞与转化'>2.2.7 CaCl₂法制备感受态细胞与转化
• 2.2.8 重组转化子的筛选
• 2.2.9 重组质粒在E.coli 中的诱导表达及目的产物的检测
• 2.2.10 酶活鉴定
• 2.2.11 过氧化氢标准曲线的绘制
• 2.3 结果
• 2.3.1 胆固醇氧化酶基因的扩增与重组质粒的构建
• 2.3.2 表达产物的SDS-PAGE 分析
• 2.3.3 表达产物的活性分析
• 2.3.4 外源蛋白的表达形式
• 2.4 讨论
• 2.4.1 信号肽对Brevibacterium sp. DGCDC-82 胆固醇氧化酶基因表达的影响
• 2.4.2 影响表达的因素分析
• 第三章 BREVIBACTERIUM SP. DGCDC-82胆固醇氧化酶基因在E.COLI中的表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株、质粒、引物和试剂
• 3.1.2 DNA 重组、转化及阳性转化子筛选
• 3.1.3 重组菌诱导表达条件的优化
• 3.1.4 表达产物的酶学性质
• 3.2 结果
• 3.2.1 重组E.coli 的构建
• 3.2.2 表达产物的SDS-PAGE 分析
• 3.2.3 胆固醇氧化酶诱导表达条件的优化
• 3.2.4 表达产物酶学性质测定
• 3.3 讨论
• 第四章 BREVIBACTERIUM SP. DGCDC-82 胆固醇氧化酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株及质粒
• 4.1.2 工具酶及试剂
• 4.1.3 主要培养基
• 4.1.4 引物
• 4.2 方法
• 4.2.1 表达载体的构建
• 4.2.2 毕赤酵母感受态细胞的制备
• 4.2.3 重组质粒pPIC9K-COD 和空质粒pPIC9K 的线性化
• 4.2.4 线性化质粒分别转化毕赤酵母
• +Mut⁺阳性克隆的筛选'>4.2.5 His⁺Mut⁺阳性克隆的筛选
• 4.2.6 G418 筛选高拷贝转化子
• 4.2.7 酵母基因组的提取
• 4.2.8 阳性重组子的PCR 鉴定
• 4.2.9 重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达
• 4.2.10 重组胆固醇氧化酶活性鉴定和SDS-PAGE 分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 毕赤酵母重组表达质粒的构建
• 4.3.2 重组毕赤酵母的筛选
• 4.3.3 重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达及产物检测
• 4.4 讨论
• 论文结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者在攻读硕士学位期间发表的论文