论文摘要
本研究利用体外特异位点重组反应成功地构建了链格孢菌JH505菌株cDNA入门文库和表达文库,并通过免疫筛选从中得到编码植物激活蛋白的核酸序列。首先提取并纯化JH505 菌株的总RNA 与mRNA,反转录合成cDNA,在cDNA 片段两端连接上attB 接头。色谱柱层析除去小片段cDNA 分子和接头。将cDNA 通过BP 重组反应与载体连接,电击转化到感受态细胞中生成cDNA 入门文库。从入门文库中挑取1×107重组克隆,利用经LR 重组反应构建cDNA 表达文库。所得到的入门文库滴度为1×107 cfu/ml,文库总容量9×107 cfu,平均插入片段大小1510Kb,阳性克隆率100%;表达文库的滴度为1.58×106 cfu/ml,文库总容量6.32×106 cfu,平均插入片段大小1680Kb,阳性克隆率100%。然后用植物激活蛋白抗血清对表达文库进行免疫筛选,得到一段包括起始密码子和终止密码子在内的1092bp 的完整编码序列,该序列编码的蛋白的分子量和等电点均与植物激活蛋白相似,初步确定其为植物激活蛋白的全长编码序列。通过NCPI Blast 比对,未发现同源序列,该蛋白为一新蛋白。链格孢菌cDNA 入门文库和表达文库的构建为链格孢菌的分子生物学研究提供了良好的材料和工具,筛选出的植物激活蛋白编码序列为植物激活蛋白的克隆与表达奠定了基础。