miR-17-5p对卵巢癌细胞生长的影响及其靶基因研究

论文摘要

[研究背景]微小RNA（microRNA,miRNA）是一类新发现的具有调控功能的长度约18-26nt的小分子非编码RNA,通过调节基因的表达在生物发育、脂肪代谢、细胞分化、增殖和凋亡等过程中发挥重要作用。近几年的研究表明,许多miRNA具有致癌基因或抑癌基因活性,在肿瘤发生和发展过程中发挥重要作用。实验室前期工作利用寡核苷酸微阵列技术发现在卵巢癌细胞中miR-17-5p表达水平明显上调。本课题研究miR-17-5p对ES-2、OVCAR3两种人卵巢癌细胞活性、增殖、凋亡及周期的影响,并确定miR-17-5p的直接靶基因,进一步研究该靶基因对细胞活性、增殖、凋亡及周期的影响,阐明miR-17-5p可能在卵巢癌细胞中发挥作用的分子机制。[方法]本实验室的前期工作验证了 miR-17-5p在卵巢癌细胞系中有较高的表达水平,以此为基础在两种卵巢癌细胞系ES-2、OVCAR3中,过表达miR-17-5p或封闭miR-17-5p,利用MTT实验、细胞生长曲线实验、TUNEL、流式细胞术分别检测细胞活性、细胞增殖能力、凋亡和细胞周期的变化。之后综合利用生物信息学方法和cDNA微阵列技术筛选出miR-17-5p的候选靶基因,并利用荧光报告载体实验验证miR-17-5p对其靶基因的直接调控作用。通过Real-time PCR和Western blot技术检测卵巢癌细胞中内源性靶基因mRNA水平和蛋白水平的变化来进一步验证miR-17-5p对其靶基因的调控作用。接着利用RNA干扰技术使靶基因表达沉默,再通过MTT实验、细胞生长曲线实验、TUNEL、流式细胞术检测细胞活性、增殖能力、凋亡和细胞周期的变化,进一步研究靶基因的功能。[结果]在两种卵巢癌细胞系中,过表达miR-17-5p增强其功能后,细胞活性、增殖能力均明显上升,细胞凋亡率减少,并加速了 S期到G2期的进程。封闭miR-17-5p抑制其功能后,细胞活性、增殖能力下降,凋亡数目明显增加,并阻滞了细胞S期到G2期的进程。靶基因筛选结果表明,YES1（V-yes-1Yamaguchi sarcoma viral oncogene homolog 1）和 CHAF1A（chromatin assembly factor 1,subunitA,p150）分别作为致癌基因和抑癌基因,是miR-17-5p的候选靶基因,其3’非翻译区包含miR-17-5p的潜在结合位点。荧光报告载体实验表明,miR-17-5p能够通过作用于YES1和CHAF1A基因的3’非翻译区（3’ untranslated region,3’UTR）的特定位点,分别对其表达进行正性和负性调节。在miR-17-5p过表达的卵巢癌细胞中,YES1基因的mRNA和蛋白表达水平明显升高,CHAF1A基因的mRNA和蛋白表达水平有明显下降。在miR-17-5p封闭的卵巢癌细胞中,YES1基因的mRNA和蛋白表达水平明显下降,CHAF1A基因的mRNA和蛋白表达水平有明显上升。将YES1基因沉默以后,细胞活性、增殖能力显著降低,细胞凋亡数目有所增加,出现了 S期到G2期的阻滞。将CHAF1A基因沉默以后,细胞活性、增殖能力增强,细胞凋亡数目减少,加速了 S期到G2期的进程。[结论]miR-17-5p能够促进卵巢癌细胞的增殖,起到致癌基因的作用。在卵巢癌细胞中miR-17-5p通过对其靶基因YES1的正性调节和对靶基因CHAF1A的负性调节影响肿瘤细胞的发生发展。本课题通过研究阐明了 miR-17-5P在卵巢癌中的作用机制和其靶基因的功能,对于我们研究卵巢癌的发生发展提供了依据,同时也为临床上卵巢癌的诊断和治疗带来了新的希望。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、miR-17-5p在卵巢癌细胞中的作用研究
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 pcDNA3/pri -miR-17-5p质粒的构建
• 1.2.2 细胞转染效率检测
• 1.2.3 Real-time PCR检测pcDNA3/pri-miR-17-5p和AS0-miR-17-5p质粒的有效性
• 1.2.4 miR-17-5p对卵巢癌细胞生长活性的影响
• 1.2.5 miR-17-5P对卵巢癌细胞增殖能力的影响
• 1.2.6 miR-17-5p对卵巢癌细胞凋亡的影响
• 1.2.7 miR-17-5P对卵巢癌细胞周期的影响
• 1.3 讨论
• 1.3.1 miR-17-5p在肿瘤中的作用
• 1.3.2 miR-17-5p对卵巢癌细胞的表型影响
• 1.4 小结
• 二、卵巢癌细胞系中miR-17-5p靶基因的确定及验证
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 靶位点预测
• 2.2.2 EGFP荧光报告载体的构建
• 2.2.3 EGFP荧光报告载体实验验证YES1、CHAF1A是miR-17-5p的直接作用靶基因
• 2.2.4 Real-Time PCR方法检测在过表达miR-17-5p或封闭miR-17-5p的ES-2细胞中YES1、CHAF1A mRNA的表达水平
• 2.2.5 Western blot检测在过表达miR-17-5p或封闭miR-17-5p的ES-2细胞中YES1、CHAF1A蛋白的表达水平
• 2.3 讨论
• 2.3.1 荧光报告载体的应用
• 2.3.2 miR-17-5p对YES1的正性调节和对CHAF1A负性的调节
• 2.4 小结
• 三、靶基因YES1、CHAF1A在卵巢癌细胞中的作用研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 pSilencer/si-YES1、pSilencer/si-CHAF1A质粒的构建
• 3.2.2 Western blot验证pSilencer/si-YES1、pSilencer/si-CHAF1A质粒的有效性
• 3.2.3 YES1、 CHAF1A对卵巢癌细胞生长活性的影响
• 3.2.4 挽救实验检测基因YES1、 CHAF1A对卵巢癌细胞生长活性的影响
• 3.2.5 YES1、CHAF1A对卵巢癌细胞增殖能力的影响
• 3.2.6 挽救实验检测YES1、CHAF1A对卵巢癌细胞增殖能力的影响
• 3.2.7 YES1、CHAF1A对卵巢癌细胞凋亡的影响
• 3.2.8 YES1、CHAF1A对卵巢癌细胞周期的影响
• 3.3 讨论
• 3.3.1 基因YES1的介绍
• 3.3.2 基因CHAF1A的介绍
• 3.3.3 基因YES1、CHAF1A与肿瘤的关系
• 3.3.4 基因YES1、CHAF1A对卵巢癌细胞生长的影响
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 miR-17-92决定簇研究进展及展望
• 综述参考文献
• 致谢