论文摘要
禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli，A PEC）引起的禽大肠杆菌病是一种重要的细菌性传染病，且易与其它病原菌、病毒并发或混合感染，成为养禽业中重要的细菌性疾病之一。在耶尔森菌中，参与耶尔森杆菌素（yersiniabactin,Ybt,铁载体）的合成转运和调节相关的毒力岛称为强毒力岛（high pathogenicity island，HPI）。其包含有一个携带有与Ybt摄取、合成和调节有关的fyuA、ybtA、irp1、irp2、irp3、irp4、irp5、irp6、irp7、 irp8和irp9等11个基因的长约30.5kb的功能核心区，天门冬氨酸tRNA（asn-tRNA）是HPI的整合位点。近年来已有研究表明，大肠杆菌等多种肠杆菌科细菌也普遍携带该毒力基因群，主要具有铁摄取与调节功能，是赋予细菌毒力和致病性的一个重要的染色体片段。为探讨禽致病性大肠杆菌强毒力岛（HPI）在禽大肠杆菌病发病过程中的作用，以野生型致病性大肠杆菌E.coli （X0904EC02）为原始菌株，依据禽大肠杆菌强毒力岛irp1irp9基因的已知序列，利用λ噬菌体Red重组系统对禽致病性大肠杆菌强毒力岛irp1irp9基因进行敲除，构建禽致病性大肠杆菌HPI缺陷型突变体。并通过LD50的测定及病理组织切片观察原始株与缺失株在致病力上的差异，探讨HPI与致病性大肠杆菌的毒力相关性。禽致病性大肠杆菌HPI缺陷型突变体主要构建步骤为：（1）根据已知大肠杆菌HPI毒力岛基因序列设计PCR敲除引物，设计的引物5′端有50bp的拟敲除基因的同源臂,3′端为扩增引物。（2）以pKD3为模板,加入高保真酶PrimeSTAR HS，按照长引物PCR扩增条件扩增两侧含FRT位点的氯霉素抗性基因,PCR产物一部分经琼脂糖凝胶电泳鉴定，另一部分用DNA纯化试剂盒进行纯化回收，并测定DNA浓度。（3）将此线性DNA转化入E.coli （X0904EC02）感受态细胞中，在Red重组系统表达重组酶的协助下，含氯霉素抗性基因的PCR产物通过其两侧的同源序列与禽大肠杆菌染色体上的基因发生同源重组，通过氯霉素抗性平板筛选得到阳性克隆。（4）对筛选得到的阳性克隆再导入编码Flp重组酶的质粒pCP20，去除抗性基因，结合PCR扩增和测序鉴定。结果表明禽致病性大肠杆菌HPI缺陷型菌株构建成功。由于突变株染色体上的HPI基因序列大部分己缺失，从而造成回复突变的可能性较小。基于突变株构建的基础上，比较分析了突变株和其野生菌株的毒力性差异。通过LD50的测定及病理组织切片观察，结果如下：（1）通过LD50测定结果表明含HPI的禽致病性大肠杆菌标准株E.coli （CVCC1565）对雏鸡具有一定的致病性，不含有HPI的非致病株对雏鸡不具备致病性；但在攻毒后， HPI全岛缺失株E.coli （X0904EC02-QS）在攻毒过程中也出现了少量死亡。（2）缺失株E.coli （X0904EC02-QS）攻毒后，病理形态学观察也出现了一些相应的病理变化，但不明显。（3）SDS-PAGE蛋白电泳检测，发现出发株在铁螯合剂2,2’-联吡啶浓度为0.3mmol/L、0.32mmol/L时，240KD处出现蛋白条带，缺失株未见到任何条带。本研究表明，APEC毒力与HPI存在密切相关性,携带HPI基因的APEC致病株在攻毒过程中存在不同程度的死亡，非致病性大肠杆菌没有携带HPI基因，在攻毒中未出现死亡；但是，HPI基因缺失株在攻毒过程中也有不同程度的死亡，从而提示致病性大肠杆菌毒力不仅仅取决于HPI，而是多因素的综合表现。