口服复方中药抗肿瘤的研究
徐凤英(海林市人民医院黑龙江海林157100)
【中图分类号】R273【文献标识码】B【文章编号】1672-5085(2009)12-0204-02
【关键词】口服复方抗肿瘤中药诱导调亡量效关系
祖国医学对于肿瘤很早就有记载，我国现存的一部医书《内经》就提到肿瘤的病因是“邪气居其间”，中国传统医学理论和实践中提到的“徵暇积聚”，即是现代医学理论和临床治疗实践中的良，恶性肿瘤疾病。徵瑕者，是脏腑之气虚弱也，聚结在内，逐渐生长，盘牢不动是徵；积聚者由阴阳不和，脏腑虚弱，受于风邪，博于脏腑之气所为也，壮人无积虚人则有之。积聚徵瑕者，皆五脏六腑正气失而邪气并，徵者系于气也，瑕者系于血也，蕴毒积久而始见脏毒也，脏毒兼阴虚温热内结痈肿，古人谓之徵瑕；积聚则为腥内之肿物，按之有形，固定不移，痛有定处，其病在脏，在血分，与现代医学的肝癌，胃癌等消化系统肿瘤症状极其相似。历代中医大家对徵瑕积聚的病因及临床治疗方面，有着详细的描述并积累了大量丰富的治疗经验。
中医认为，恶性肿瘤的发展与机体的正气不足密切相关，恶性肿瘤临床治疗的实践观察表明，正气不足般体虚弱，贯穿在恶性肿瘤病人的发病和治疗过程始终。现代医学的基础和临床研究表明：恶性肿瘤的发生和发展与机体的免疫系统功能状态密切相关，恶性肿瘤临床治疗的实践观察也充分表明，免疫系统功能状态，对恶性肿瘤病人的治疗过程和雨后密切相关。充分显示，中医学和现代医学对肿瘤形成的病因和治疗方法上的一致性。复方人参煎剂，由传统名贵中药人参、黄芪、刺五加等味药组成。人参：大补元气，补肺益脾，能回肺中元气与垂绝之乡，补
五脏除邪气。对多种肿瘤细胞有破坏抑制作用，对人肝癌细胞有逆转作用。黄芪：补元气，益肺生津，黄芪煎液能促进机体免疫因子白介素-2；干拢素的生成。刺五加：为天然免疫适应原样物质，具有独特的刺激内源性免疫功能的作用。
中晚期肿瘤病人多为脾胃气虚，症见：面色萎黄，倦怠乏力，心悸气短，津液耗竭，中气不足，五脏气虚，运化失司，水湿停滞，痰凝湿聚，胸水，腹痛，胸闷气促，神疲乏力，舌淡，脉细等，上述诸多病状，均为人参，黄芪药物的治疗适应症。
大多数中晚期肿瘤病人多有头晕目眩，神疲乏力，少气懒言，自汗，动则喘促等气虚表现，以及面色萎黄火光白，唇色淡白，脉细无力等气血两虚表现，上述诸多症状，也均为人参，黄芪药物治疗的主要适应症。
由传统名贵中药人参，黄芪，刺五加等味药组成复方人参煎剂，用于临床后，对大多数中晚期肿瘤患者都收到了明显的治疗效果，无论是单用还是与化疗联用，无论是止痛还是提高生命质量还是延长病人生存时间等方面，都显示出了中药抗肿瘤的独特作用。
鉴于此，对复方人参煎剂进行如下的实验室研究
1实验目的
观察口服复方抗肿瘤中药对移植于裸鼠的人肝癌bel-7402细胞株有否诱导调亡的作用。
细胞调亡是指有核细胞在一定条件下，通过激活细胞自身的内部机制，特别是启动或关闭某些以及内源性DNA内切酶的活性后，所导致的细胞自然性死亡的过程。细胞调亡与肿瘤的发生，发展和预防有密切关系，是目前基础医学多学科的研究重点。目前常用的研究药物诱导细胞调亡的指标有三个：①癌细胞形态学的变化；②流式细胞仪（FCM）对细胞周期的分析；③DNA琼脂糖凝胶电泳测定。本实验依照上述三项指标进行实验设计与观察。近年来的研究证明多数抗肿瘤药物具有杀灭和诱导肿瘤发生调亡（Apoptosis），即程序性死亡（programmedcelldeathPCD）的双项作用，其抑瘤活性的力度与其诱导细胞调亡作用的强弱相平行，这一现象有助于调亡机理的探讨，并为研究能够诱导细胞调亡的高效抗肿瘤药物，提供理论和实验依据。
2材料和方法
2.1细胞株人肝癌Bel-7402细胞株，由中国医学科学院肿瘤研究所药理室常规保存。
2.2动物BALBC/C系裸鼠，SPT级动物，雄性16～18g，由中国医学科学院实验动物中心提供。合格证号：京动许字2004-017，设施合格证号：SYXK（京）2002-0016。
2.3药物口服复方抗肿瘤中药，深棕色液体，生药浓度80.48％批号040405；复方中药抗肿瘤注射液，棕色液体，生药浓度40.24％；批号050505，鼎新药研所提供。5-服50mg/10ml上海旭东海普药业公司生产。
2.4试剂琼脂糖（美国BRL产品），荧光染料碘化丙啶（华美生物技术公司产品），核糖酸酶A。蛋白酶K（sigma公司产品）；EDTA、戊二醛、锇酸、EPON812环氧树脂、醋酸铀、柠檬酸铅、乙醇、酚、氯仿、异戊醇等试剂均为国产品。
2.5仪器透射电镜ELECTRONMICROSCOPE（美国）；
流式细胞仪COULTER，EPICSELITE型（美国）；电泳仪DYY-118型稳压流定时电泳仪（北京六一仪器厂生产）；二氧化碳培养箱EVICO公司产品（美国）；高速冷冻离心机，切片机,移液器等。
2.6试验方法在BALBC/C系裸鼠右腋窝下接种已在裸鼠体内传代生长良好的人肝癌Bel-7402肿瘤组织快，在超净台内无菌操作取出中瘤节，选取五坏死的组织采取常规小块接种法，1块/鼠（约1mm）待肿瘤生长至可视并可触及时，将动物随机分成5组，每组5只，称体重并编号。分为①空白对照组：NS20ml/kg，po×10，QD;②阳性药5-Fu对照组：25ml/kgip×5次，QOD；③口服复方抗肿瘤中药低剂量组（3.4g/kg）po×10次，QD；④口服复方抗肿瘤中药中剂量组（5.0g/kg）po×10次，QD；⑤口服复方抗肿瘤中药高剂量组（10.0g/kg）po×10次。实验期间每日给药一次。实验裸鼠在室湿20-22℃，相对温度40-60℃，具有屏蔽系统畏以洁净层流柜的环境内饲养。设施合格证号：SYYK（京）2002-0016。末次给药结束后24h，处死动物，于无菌条件下剥取瘤结，并从中切取部分癌组织分别用作检测细胞调亡的三项指标。
3结果
3.1Bel-7402细胞的电镜下观察在透射电镜下观察到，移植于裸鼠的人肝癌Bel-7402细胞，经使用5-Fu和口服复方抗肿瘤中药后，其超微结构出现了一系列明显的形态学改变：胞浆致密、胞核浓缩、胞膜变皱、核染色质浓集断裂且明显迁移到核膜内侧，细胞内容物不外溢，部分细胞可见到胞浆空泡，但细胞膜均保持完整。上述改变均系典型的细胞调亡表现，且显示出明显的量-效差异。空白对照组的癌细胞则无上述形态学的改变。
3.2流式细胞仪测定空白对照组和口服复方抗肿瘤中药剂量3.4g/kg均未出现显示细胞仪测定：空白对照组和口服复方抗肿瘤中药剂量3.4g/kg均未出现显示细胞调亡特征的亚G1高峰（调亡峰），而5-Fu组，口服复方抗肿瘤中药中5.0g/kg，高10.0g/kg剂量组，均出现G1高峰，S期细胞减少，G2M期细胞增加。
3.3DNA琼脂粮凝胶电泳DNA寡聚核小体间区片段是细胞调亡具有标志性意义的分子学和细胞学过程，这种寡聚核小体在DNA琼脂糖凝胶电泳上出现特征性DNA梯形带（DNALadder）。DNALadder的出现。是细胞内源性核酸内切酶被激活，将染色质DNA降解成寡聚核小体的结果。Bel-7402细胞在使用了5-Fu和口服复方抗肿瘤中药三个剂量组的药物后，经6h电泳，均出现了清晰且典型的DNA梯形带，而且对照组在同样时间内则无此表现。说明口服复方抗肿瘤中药且有能够诱导Bel-7402细胞发生调亡。
4讨论
口服复方抗肿瘤中药是在复方中药抗肿瘤注射液的基础上改变给药途径而研制的抗肿瘤中药。近年来的研究证明，多数抗肿瘤药物具有杀灭和诱导肿瘤细胞发生调亡（Apoptosis），即程序性死亡（programmedcelldeathPCD）双项作用，且抑瘤活性的力度与其诱导细胞调亡作用的弱项相平行。本实验结果显示，口服复方抗肿瘤中药中、高剂量对移植于裸鼠的人肝癌Bel-7402细胞株确有能够诱导癌细胞调亡的作用。本实验结果，为口服复方抗肿瘤中药的研制，提供理论和实验基础。