本文主要研究内容
作者徐巨才（2019）在《停流型二维液相色谱系统的构建及其在食源性蛋白水解物分离及活性在线检测中的应用》一文中研究指出：食源性生物活性肽具有安全性高、易吸收、来源广等多种优点,越来越受到科研学者的关注。然而,受传统分离纯化技术效率限制,目前已报道的生物活性肽段序列很少,因此,发展一种可同时实现食源性蛋白水解物快速分离、活性肽段检测和结构鉴定的技术手段是目前亟需解决的问题。本文分别探讨了肽分子在停流型二维液相色谱(2D-LC)中第一维凝胶色谱(SEC)和反相色谱(RPLC)的额外峰展宽情况,并对现有二维色谱峰检测方法进行了一系列改善,在此基础上,构建了快速停流型SEC×RPLC-MS系统用于改善食源性蛋白水解物中肽段的分离和鉴定,与此同时,本文进一步构建了停流型RPLC×SEC-MS/DPPH自由基清除活性分析系统,用于食源性蛋白水解物中活性肽段的快速检测和鉴定。本文主要研究内容和结果如下:(1)构建了一种常规全自动停流型SEC×RPLC二维液相色谱,并系统研究了停流操作对停流型2D-LC中第一维SEC分离的影响,结果表明:大分子蛋白质或多肽在第一维SEC停流分析过程中的额外峰展宽极小,而小分子肽的额外峰展宽相对较大,但可通过调整其停流时间和分析温度对其进行控制,此外,停流位置和停流次数对样品在第一维SEC中的额外峰展宽影响极小。将该停流型SEC×RPLC应用于花生蛋白水解物的分离,获得了明显优于单维液相色谱的分离效果,其全二维分离峰容量高达504。(2)在停流型SEC×RPLC的基础上,将两个维度的色谱柱互换并对阀切换结构进行改良,进一步构建了一种可用于蛋白水解物分子量分析的常规停流型RPLC×SEC二维液相色谱,并系统性研究了第一维RPLC的额外峰展宽情况,结果表明:分子量较大或保留时间较长的物质在第一维RPLC中额外峰展宽均较小,仅有保留时间较短的小分子物质存在较为严重的额外峰展宽。将该停流型RPLC×SEC用于食源性蛋白水解物的分离分析,发现第一维RPLC分离可大大降低第二维SEC的分离难度,改善其分离效果。与停流型SEC×RPLC相比,停流型RPLC×SEC的全二维分离速度较慢且峰容量较低(仅为200左右),但该系统可用于测定第一维RPLC全流出组分的分子量分布情况,同时,还可用于更准确地测定第一维RPLC特定流出组分的分子量。(3)基于原两步检测法,对二维液相色谱峰检测方法进行了改良。在新方法中,引入了保留时间判定和双向峰重叠判定,其中保留时间判定可根据第一维流出组分的不同采取不同的色谱峰偏移阈值,以适用于采用可变第二维液相色谱梯度的二维液相色谱峰检测,而双向峰重叠可支持设定峰宽对比高度,以减小峰拖尾对二维液相色谱峰检测的影响。新方法在常规分离、第一维欠采样和第二维采用可变梯度时所获得的复杂二维液相色谱数据中均获得了较好的检测效果,正确检测率均高于60%。与原Peters方法相比,新方法所得二维色谱峰检测的正确率至少提高了6%。(4)对常规停流型SEC×RPLC的第二维液相色谱(~2D-LC)进行升级,构建了一种基于常规离子源的快速停流型SEC×RPLC-MS系统,并对其分离条件进行了优化,应用于食源性蛋白水解物的肽组学分析。结果表明:超高效UPLC SEC与HSS T3柱可作为食源性蛋白水解物二维分离的较优色谱柱对,结合进一步的进样量、组分转移体积及死体积优化,该二维色谱分离效果大大改善,峰容量高达1165,体现了其对复杂样品的强大分离能力。在玉米蛋白水解物的分离和鉴定试验中,快速停流型SEC×RPLC-MS的PSMs(母离子二级谱匹配数量)较传统1D-LC-MS提高了至少25%,MS2采集数量提高了至少两倍。将该系统进一步应用于大豆肽及酪蛋白水解物的肽段分离和鉴定,实际峰检测数量均超过200,PSMs鉴定量均超过9 k,而MS2采集量更是超过了50 k,充分展现了快速停流型SEC×RPLC-MS对食源性蛋白水解物的强大分离和鉴定能力。此外,通过将该鉴定结果与Biopep活性肽段数据库进行对比,快速地发现了酪蛋白水解物中的6条已知活性肽段,同时发现了大量包含活性片段的潜在生物活性肽段。(5)在常规停流型RPLC×SEC的基础上,对其停流型阀切换结构进行进一步的改良,并对其~2D-LC进行升级,构建了停流型RPLC×SEC-MS/DPPH自由基清除活性分析系统。通过探讨反应环管路长短、DPPH·浓度、温度及甲酸添加量对第二维SEC-DPPH自由基清除活性分析的影响,确定了第二维SEC-DPPH自由基清除活性分析的适宜条件为:反应环10 m、DPPH·浓度200μM、温度40℃、甲酸添加量0.06%。通过谷胱甘肽标准品的停流型RPLC×SEC-MS/DPPH自由基清除活性分析,对该系统的有效性进行了充分验证,在此基础上,进一步将其应用于复杂混合标准品的分析,成功从复杂混标中鉴定到了具有强DPPH自由基清除活性的二肽GC和CW,并对上述两种二肽进行了验证,展示了该系统较强的创新性、有效性和实用性。
Abstract
shi yuan xing sheng wu huo xing tai ju you an quan xing gao 、yi xi shou 、lai yuan an deng duo chong you dian ,yue lai yue shou dao ke yan xue zhe de guan zhu 。ran er ,shou chuan tong fen li chun hua ji shu xiao lv xian zhi ,mu qian yi bao dao de sheng wu huo xing tai duan xu lie hen shao ,yin ci ,fa zhan yi chong ke tong shi shi xian shi yuan xing dan bai shui jie wu kuai su fen li 、huo xing tai duan jian ce he jie gou jian ding de ji shu shou duan shi mu qian ji xu jie jue de wen ti 。ben wen fen bie tan tao le tai fen zi zai ting liu xing er wei ye xiang se pu (2D-LC)zhong di yi wei ning jiao se pu (SEC)he fan xiang se pu (RPLC)de e wai feng zhan kuan qing kuang ,bing dui xian you er wei se pu feng jian ce fang fa jin hang le yi ji lie gai shan ,zai ci ji chu shang ,gou jian le kuai su ting liu xing SEC×RPLC-MSji tong yong yu gai shan shi yuan xing dan bai shui jie wu zhong tai duan de fen li he jian ding ,yu ci tong shi ,ben wen jin yi bu gou jian le ting liu xing RPLC×SEC-MS/DPPHzi you ji qing chu huo xing fen xi ji tong ,yong yu shi yuan xing dan bai shui jie wu zhong huo xing tai duan de kuai su jian ce he jian ding 。ben wen zhu yao yan jiu nei rong he jie guo ru xia :(1)gou jian le yi chong chang gui quan zi dong ting liu xing SEC×RPLCer wei ye xiang se pu ,bing ji tong yan jiu le ting liu cao zuo dui ting liu xing 2D-LCzhong di yi wei SECfen li de ying xiang ,jie guo biao ming :da fen zi dan bai zhi huo duo tai zai di yi wei SECting liu fen xi guo cheng zhong de e wai feng zhan kuan ji xiao ,er xiao fen zi tai de e wai feng zhan kuan xiang dui jiao da ,dan ke tong guo diao zheng ji ting liu shi jian he fen xi wen du dui ji jin hang kong zhi ,ci wai ,ting liu wei zhi he ting liu ci shu dui yang pin zai di yi wei SECzhong de e wai feng zhan kuan ying xiang ji xiao 。jiang gai ting liu xing SEC×RPLCying yong yu hua sheng dan bai shui jie wu de fen li ,huo de le ming xian you yu chan wei ye xiang se pu de fen li xiao guo ,ji quan er wei fen li feng rong liang gao da 504。(2)zai ting liu xing SEC×RPLCde ji chu shang ,jiang liang ge wei du de se pu zhu hu huan bing dui fa qie huan jie gou jin hang gai liang ,jin yi bu gou jian le yi chong ke yong yu dan bai shui jie wu fen zi liang fen xi de chang gui ting liu xing RPLC×SECer wei ye xiang se pu ,bing ji tong xing yan jiu le di yi wei RPLCde e wai feng zhan kuan qing kuang ,jie guo biao ming :fen zi liang jiao da huo bao liu shi jian jiao chang de wu zhi zai di yi wei RPLCzhong e wai feng zhan kuan jun jiao xiao ,jin you bao liu shi jian jiao duan de xiao fen zi wu zhi cun zai jiao wei yan chong de e wai feng zhan kuan 。jiang gai ting liu xing RPLC×SECyong yu shi yuan xing dan bai shui jie wu de fen li fen xi ,fa xian di yi wei RPLCfen li ke da da jiang di di er wei SECde fen li nan du ,gai shan ji fen li xiao guo 。yu ting liu xing SEC×RPLCxiang bi ,ting liu xing RPLC×SECde quan er wei fen li su du jiao man ju feng rong liang jiao di (jin wei 200zuo you ),dan gai ji tong ke yong yu ce ding di yi wei RPLCquan liu chu zu fen de fen zi liang fen bu qing kuang ,tong shi ,hai ke yong yu geng zhun que de ce ding di yi wei RPLCte ding liu chu zu fen de fen zi liang 。(3)ji yu yuan liang bu jian ce fa ,dui er wei ye xiang se pu feng jian ce fang fa jin hang le gai liang 。zai xin fang fa zhong ,yin ru le bao liu shi jian pan ding he shuang xiang feng chong die pan ding ,ji zhong bao liu shi jian pan ding ke gen ju di yi wei liu chu zu fen de bu tong cai qu bu tong de se pu feng pian yi yu zhi ,yi kuo yong yu cai yong ke bian di er wei ye xiang se pu ti du de er wei ye xiang se pu feng jian ce ,er shuang xiang feng chong die ke zhi chi she ding feng kuan dui bi gao du ,yi jian xiao feng tuo wei dui er wei ye xiang se pu feng jian ce de ying xiang 。xin fang fa zai chang gui fen li 、di yi wei qian cai yang he di er wei cai yong ke bian ti du shi suo huo de de fu za er wei ye xiang se pu shu ju zhong jun huo de le jiao hao de jian ce xiao guo ,zheng que jian ce lv jun gao yu 60%。yu yuan Petersfang fa xiang bi ,xin fang fa suo de er wei se pu feng jian ce de zheng que lv zhi shao di gao le 6%。(4)dui chang gui ting liu xing SEC×RPLCde di er wei ye xiang se pu (~2D-LC)jin hang sheng ji ,gou jian le yi chong ji yu chang gui li zi yuan de kuai su ting liu xing SEC×RPLC-MSji tong ,bing dui ji fen li tiao jian jin hang le you hua ,ying yong yu shi yuan xing dan bai shui jie wu de tai zu xue fen xi 。jie guo biao ming :chao gao xiao UPLC SECyu HSS T3zhu ke zuo wei shi yuan xing dan bai shui jie wu er wei fen li de jiao you se pu zhu dui ,jie ge jin yi bu de jin yang liang 、zu fen zhuai yi ti ji ji si ti ji you hua ,gai er wei se pu fen li xiao guo da da gai shan ,feng rong liang gao da 1165,ti xian le ji dui fu za yang pin de jiang da fen li neng li 。zai yu mi dan bai shui jie wu de fen li he jian ding shi yan zhong ,kuai su ting liu xing SEC×RPLC-MSde PSMs(mu li zi er ji pu pi pei shu liang )jiao chuan tong 1D-LC-MSdi gao le zhi shao 25%,MS2cai ji shu liang di gao le zhi shao liang bei 。jiang gai ji tong jin yi bu ying yong yu da dou tai ji lao dan bai shui jie wu de tai duan fen li he jian ding ,shi ji feng jian ce shu liang jun chao guo 200,PSMsjian ding liang jun chao guo 9 k,er MS2cai ji liang geng shi chao guo le 50 k,chong fen zhan xian le kuai su ting liu xing SEC×RPLC-MSdui shi yuan xing dan bai shui jie wu de jiang da fen li he jian ding neng li 。ci wai ,tong guo jiang gai jian ding jie guo yu Biopephuo xing tai duan shu ju ku jin hang dui bi ,kuai su de fa xian le lao dan bai shui jie wu zhong de 6tiao yi zhi huo xing tai duan ,tong shi fa xian le da liang bao han huo xing pian duan de qian zai sheng wu huo xing tai duan 。(5)zai chang gui ting liu xing RPLC×SECde ji chu shang ,dui ji ting liu xing fa qie huan jie gou jin hang jin yi bu de gai liang ,bing dui ji ~2D-LCjin hang sheng ji ,gou jian le ting liu xing RPLC×SEC-MS/DPPHzi you ji qing chu huo xing fen xi ji tong 。tong guo tan tao fan ying huan guan lu chang duan 、DPPH·nong du 、wen du ji jia suan tian jia liang dui di er wei SEC-DPPHzi you ji qing chu huo xing fen xi de ying xiang ,que ding le di er wei SEC-DPPHzi you ji qing chu huo xing fen xi de kuo yi tiao jian wei :fan ying huan 10 m、DPPH·nong du 200μM、wen du 40℃、jia suan tian jia liang 0.06%。tong guo gu guang gan tai biao zhun pin de ting liu xing RPLC×SEC-MS/DPPHzi you ji qing chu huo xing fen xi ,dui gai ji tong de you xiao xing jin hang le chong fen yan zheng ,zai ci ji chu shang ,jin yi bu jiang ji ying yong yu fu za hun ge biao zhun pin de fen xi ,cheng gong cong fu za hun biao zhong jian ding dao le ju you jiang DPPHzi you ji qing chu huo xing de er tai GChe CW,bing dui shang shu liang chong er tai jin hang le yan zheng ,zhan shi le gai ji tong jiao jiang de chuang xin xing 、you xiao xing he shi yong xing 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自华南理工大学的徐巨才，发表于刊物华南理工大学2019-10-23论文，是一篇关于停流型二维液相色谱论文,二维色谱峰检测论文,二维液质论文,肽组学论文,在线活性检测论文,华南理工大学2019-10-23论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自华南理工大学2019-10-23论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
标签：停流型二维液相色谱论文; 二维色谱峰检测论文; 二维液质论文; 肽组学论文; 在线活性检测论文; 华南理工大学2019-10-23论文;