猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的原核表达及其单克隆抗体的研制

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。PRRS自1987年首次报道发现于美国以来,现已遍及世界各主要养猪国家与地区,并己成为危害养猪业最严重的传染病之一。在PRRSV编码的各种蛋白中,核衣壳蛋白（N蛋白）作为病毒粒子中含量最高、免疫原性最强的结构蛋白之一,对于PRRS的诊断及监控防治具有重要意义。本研究以江苏地区的分离株SY株PRRSV为研究对象,在克隆并鉴定该病毒N基因的基础上,进行N蛋白的原核表达,并制备相应单克隆抗体,为检测方法的建立及结构蛋白的研究奠定了基础。1、PRRSV N基因的克隆及原核表达根据GeneBank发表的PRRSV ATCC VR-2332株N基因序列,设计并合成一对引物,利用RT-PCR方法扩增N基因片段。将扩增片段克隆至pGEM-T Easy载体中,构建N基因重组载体pGEM-T-N。经核苷酸序列测定,克隆的基因片段长372bp,为N基因开放性读码框的全长序列,编码123个氨基酸。将N基因片段连接至pGEX-6P-1表达载体中,经抗性筛选和限制性内切酶分析,获得阳性克隆pGEX-6P-1-N。将pGEX-6P-1-N质粒转化E.coli BL21感受态细胞,筛选到重组菌pGEX-6p-1-N/BL21,用IPTG诱导重组菌表达N蛋白。经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,获得的融合蛋白分子量约为36.5kDa,大小与预期相一致,且具有良好的抗原特异性。对融合蛋白表达条件进行优化,确定诱导剂IPTG的浓度为0.8mM,诱导时间为4h。融合蛋白以包涵体形式出现,经含有尿素的溶液洗涤得以初步纯化。2、PRRSV N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定本研究通过在Marc-145上增殖PRRSV,将收获的病毒经差速离心和PEG沉淀进行初步提纯和浓缩。将浓缩的病毒以及GST-N融合蛋白分别免疫BALB/C小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。用间接ELISA方法筛选阳性克隆,并采用有限稀释法对其进行亚克隆,共获得10株能稳定分泌抗PRRSV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为P1A1、P1A2、P1C5、P2D3、P2G7、P5E5、P6G7、P7F2、P7E8和N1H4。单抗N1H4亚类为IgM,其余均属于IgG1。所有单抗具有良好的特异性,与PPV、PRV、PCV2、HCV无交叉反应。Weasern-blot分析结果进一步证实所获单抗是针对病毒的核衣壳蛋白,且能与之发生特异性结合反应。采用相加ELISA方法,对单抗识别的抗原表位进行分析,初步表明P6G7和N1H4同其它单抗识别不同的抗原表位。利用这些单抗初步建立了间接ELISA、Dot-ELISA和间接免疫荧光（IFA）等特异性检测PRRSV抗原的方法,为进一步建立敏感性高、特异性强、简便快速的PRRS诊断方法打下了基础。

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符号说明

综述猪繁殖与呼吸综合征研究进展

1. PRRSV 的基本特性

2. PRRSV 的分子生物学研究进展

3. PRRSV 主要结构蛋白的体外表达

4. PRRSV 分离株的遗传变异性

5. 猪繁殖与呼吸综合征诊断方法的研究进展

6. 结语

第一章猪繁殖与呼吸综合征病毒 N 基因的克隆及原核表达

1. 材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

5. 总结

第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒 N 蛋白单克隆抗体的制备