大鼠肝脏线粒体极长链乙酰辅酶A脱氢酶的表达、纯化及G441突变的鉴定

论文摘要

线粒体脂肪酸β-氧化是心脏和骨骼肌代谢过程中的主要能量来源,尤其是肝脏线粒体β-氧化产生的酮体,在运动、禁食或饥饿状态下对机体供能发挥重要作用。乙酰辅酶A脱氢酶（Acyl-CoA dehydrogenases, ACADs）是线粒体黄素酶,它有11个亚型,其中短链乙酰辅酶A脱氢酶、中链乙酰辅酶A脱氢酶、长链乙酰辅酶A脱氢酶、极长链乙酰辅酶A脱氢酶和乙酰辅酶A脱氢酶9是线粒体β-氧化催化各种长度的直链脂肪酸的第一步反应的重要的酶。而这五种ACADs的分子量,结构和分布不同,各有特性。极长链乙酰辅酶A脱氢酶（Very-long-chain acyl-CoA dehydrogenase, VLCAD）和ACAD-9均为同源二聚体,其分子量约为66.5kDa,其余的三种ACADs则为同源四聚体结构,分子量为43-45kDa。VLCAD在线粒体内膜结合,不易提取,需加入清托剂溶膜方能被分离,而其他3种ACADs分布于线粒体基质中,无需溶解,易被提取。VLCAD是ACADs家族中的重要一员,它是线粒体β-氧化中催化长链脂肪酸第一步反应中的关键酶。棕榈酰辅酶A（C16）和硬脂酰辅酶A（C18）是植物和动物组织中最丰富的脂肪酸化合物,主要由VLCAD进行催化。研究表明,VLCAD对C16的活性是LCAD的10倍。VLCAD缺乏会导致脂肪酸β-氧化障碍,C16水平明显升高,从而对心脏、肌肉、肝脏产生严重不良影响。与其它β-氧化紊乱比较,VLCAD缺乏症均有早期发病、临床表现形式不一、临床症状严重、死亡率高（75%于发病2个月内死亡）等特点,且大多数VLCAD缺乏患者均有不同程度心功能和肝功能异常。目前使用串联质谱法来检测疑似病例中血浆酰基肉碱的表征,并通过分析研究成纤维细胞或淋巴细胞的脂肪酸氧化和／或VLCAD的基因序列可以确诊VLCAD缺乏。尽管在欧美等国VLCAD缺乏已成为新生儿疾病常规筛查的一部分,但由于症状的多样性及需要在适当的时间收集血液和尿液标本进行相关的代谢调查,仍然有大量的VLCAD缺乏症被漏诊。同时,利用目前的手段仅能判断患者是否存在VLCAD缺乏却不能评估VLCAD缺乏的程度。目前尚无确切的治疗VLCAD缺乏症的方法,主要是避免禁食,增加高碳水化合物和中链甘油三酯的摄入,减少长链脂肪饮食。尽管有很多学者对脂肪酸β-氧化和VLCAD缺乏进行了大量研究,但其分子机制仍不明确,从而阻碍了疾病的诊断和合理治疗。迄今为止已知的VLCAD缺乏症的突变位点有80多个,基因表型各不相同。且仅有少数突变位点得到了研究。甘氨酸-441（Glycine, Gly, G）是在人类、动物、细菌中均存在的VLCAD蛋白氨基酸。在人类的VLCAD缺乏症中,G441D突变被称为致病的突变,其表型为新生儿型和肌肉型。然而对这个突变尚没有分子和功能的研究。综上所述,在本实验中我们利用原核细菌表达系统来表达VLCAD蛋白和其G441突变点,为研究G441突变点对VLCAD蛋白的结构和功能影响奠定基础,并为VLCAD缺乏的新治疗提供理论依据。1.PCR扩增以大鼠肝脏线粒体cDNA作为野生型（Wild type, WT） VLCAD蛋白的模板,设计VLCAD引物如下：Forward5’cgc gcg gat cca gga gga att taa aat gag agg atc gca tca cca tca cca tca cgc cag tga ggc cac tca ggc agt tct gga3’,其中含BamHI （GGATCC）酶切位点和CATCACCATCACCATCAC为六个组氨酸标签。Reverse5’ctg cag agt act tta gac tct aag ggg gtt act ggt gac cag3’,其中含Scal（AGTACT）酶切位点。2.鉴定PCR产物3.产物回收回收阳性PCR产物,回收后的PCR产物和pLM1载体进行Scal和Bam HI双酶切。4.连接载体和目的片段将连接成VLCAD::pLM1。使用Scal酶和Bam HI酶进行单酶切和双酶切来鉴定已连接的VLCAD::pLM1。5.转化阳性的VLCAD::pLM1转化到TOP10感受态细胞,并克隆筛选。阳性克隆在E. coli strain BL21（DE3）进行表达转化。经过蛋白质条件表达并电泳后,可确定最佳的IPTG浓度及温度为0.5mM IPTG,室温。6.纯化大规模表达蛋白质并纯化。使用Hitrap Chelating HP （1ml）柱纯化蛋白。首先按照平衡Hitrap柱用5ml水洗,然后均匀打入5ml NiSO4,可看到柱子变成蓝色。水洗去未结合的Ni2+,然后用5-7ml Start Buffer平衡柱子。将粗蛋白均匀打入柱内后,用5ml Washing Buffer洗蛋白,此时不含有六个组氨酸标签的蛋白质因为结合能力不强,即随着Washing Buffer洗下,收集第二管的样品用于分析蛋白质的表达情况。然后用Elution Buffer洗蛋白。纯化出来的样品可用于下面的分析。7.设计定点突变G441D引物：Forward5’GATAATGGGGGGCATGGATTTCATGAAGGAACCAG3’ Reverse5’CTGGTTCCTTCATGAAATCCATGCCCCCCATTATC3’G441A引物：Forward5’GATAATGGGGGGCATGGCGTTCATGAAGGAACCAG3’ Reverse5’CTGGTTCCTTCATGAACGCCATGCCCCCCATTATC3’经过PCR反应,转化后挑选克隆子,进行DNA测序。经过测序比对,突变正确的克隆按照上述方法提取质粒,然后转化表达蛋白,表达条件、纯化方法、测试方法同WT蛋白。8.蛋白测试分析通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白的分子量和纯度。使用紫外可见（Ultraviolet visible, UV-Vis）光谱扫描仪测试WT蛋白及突变蛋白对C18、C16、C14、C12、C8的活性。使用Bradford方法进行蛋白定量分析。1. VLCAD蛋白基因的克隆通过PCR扩增得到了VLCAD蛋白PCR产物,显示为约1.8KB基因长度。2.连接反应及阳性克隆的筛选PCR产物与pLM1载体连接成VLCAD::pLM1,并使用Scal和BamHI进行单、双酶切。单酶切显示约5.7KB,双酶切显示分别约为3.9KB和1.8KB。由电泳结果可知,连接反应与阳性克隆的筛选成功。3. VLCAD蛋白分析将收集到的样品用SDS-PAGE分析蛋白质纯化的情况。其分子量约为66.5KDa。以上结果表明,VLCAD蛋白表达正确,且纯度高。4.分子模拟VLCAD蛋白4.1.VLCAD蛋白序列的同源比对使用Clustal W软件对来源不同的VLCAD蛋白序列进行同源比对,根据比对的结果可知,G441为高度保守的氨基酸。4.2.VLCAD蛋白分子模型图使用Discovery Studio3.1软件对VLCAD蛋白分子模型图进行模拟。可模拟出VLCAD蛋白关键位点氨基酸参加与黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide, FAD）辅因子的三维结构图。Glu-462, Trp-249, Thr-217, Ser-223,Arg-366,Gln-435,Gly-439参加与FAD结合。而G441是唯一高度保守的独特序列（Gly-Gly-X-Gly图案：Gly丰富序列）。5.突变蛋白质检测将纯化出来的突变蛋白G441D和G441A样品进行SDS-PAGE电泳分析,突变蛋白与WT蛋白比较,分子量均为66.5KDa。6.VLCAD蛋白光谱及活性分析已纯化出来的突变蛋白与WT蛋白均呈黄色,如图3-7所示。对他们进行紫外分光光度计分析,WT蛋白光谱有三个峰值,分别为274,374和449nm其比例为4.86：0.88：1。WT蛋白和突变蛋白的光谱吸收显示没有很大的差异。7.WT蛋白及突变蛋白定量、活性及酶动力学测试7.1. WT蛋白定量为11.11mg/2L,突变G441D及G441A为10.34mg/2L和10.40mg/2L,三者之间没有很明显的差异。7.2.突变蛋白和WT蛋白均对C16活性最高。但突变蛋白G441D和G441A对C16的活性分别为11%和25%,明显低于WT蛋白对C16的活性。7.3.实验表明,与WT蛋白相比,G441突变型的反应速度显著降低,其KM是突变酶的3-4倍。ACADs是人体内重要的化学物质,它不仅是丙酮酸脱羧,脂肪酸p-氧化的产物,也是脂肪酸合成、胆固醇合成和生酮作用的碳来源。ACADs有11个亚型,VLCAD蛋白是ACADs蛋白家族中一个重要的蛋白。它是线粒体β-氧化中催化长链脂肪酸第一步反应中的关键酶。1993年Bertrand首次报道了VLCAD缺乏症,使人们第一次认识到VLCAD缺乏可导致严重的心肌病变、肝功能异常和肌肉代谢障碍。VLCAD缺乏死亡率极高,尤其在新生儿中,一旦发病,2个月内患儿死亡率甚至高达75%,其中有相当一部分病例在尸检时才被确诊为VLCAD缺乏症。随着该病检测手段和技术的进步,被确诊为VLCAD缺乏症的患者人数明显增加。但由于该病起病急,病情进展迅速,确诊时取样时间受限制,且大多数国家尚未普及筛查,因此仍有大量的病例被误诊和漏诊。同时,尽管目前有一些关于VLCAD缺乏症的研究,但其发病机制尚不完全明确。而目前的诊断方法也不能评估VLCAD缺乏症的严重程度。因此,研究VLCAD蛋白和其特定突变点的蛋白表达及功能将为阐明VLCAD缺乏症的分子机制和防治研究提供理论依据。我们从美国国立生物技术信息中心（NCBI）检索VLCAD同源蛋白数据库序列,使用Clustal W软件作出多序列比对,发现大鼠肝脏线粒体VLCAD蛋白与人类肝脏线粒体VLCAD蛋白质序列具有85%的相似度。研究表明,分子功能与序列标识的相似性相关。若两条蛋白基因序列相似性达80%则被认为是同源基因,而大鼠和人类的VLCAD蛋白基因序列相似性高达85%,提示人类和大鼠VLCAD蛋白具有相似的功能。因此,在本研究中,我们使用原核大肠杆菌系统克隆大鼠肝脏线粒体VLCAD蛋白,用于研究人类WT蛋白和突变蛋白的表达、纯化及突变蛋白的功能变化。本实验成功克隆了大鼠肝脏线粒体WT蛋白基因。PCR扩增后得到的PCR产物显示约为1.8KB基因长度。通过单、双酶切成功地将阳性PCR产物与pLM1载体连接成VLCAD::pLM1。并经DNA测序比对确认其为正确的克隆。将克隆的WT VLCAD蛋白基因进行纯化,显示其分子量约为66.5KDa,与以往的报告一致。在既往研究中,常常需要3-4个步骤才能得到纯化产物,且每个步骤都有可能会丢失一些产物。因此,若要达到目标产量和理想纯度的需求,应尽可能的减少纯化步骤。我们在实验过程中,使用了六个组氨酸标签和金属螯合亲和层析介质,运用亲和层析法纯化WT-VLCAD蛋白,使得整个纯化过程仅需一步即可完成,大大地缩短了实验流程,简化了实验操作,并提高了产物纯度。应用同样的方法我们得到了特定突变点的VLCAD蛋白。目前已知的VLCAD缺乏症的突变有80多个位点,基因表型各不相同。且仅有少数突变位已有相关研究。其中G441蛋白氨基酸突变可导致严重的VLCAD缺乏,其表现为心肌病变和肌肉代谢异常。在人类ACADs家族中,与各种来源（动物、细菌）的VLCAD蛋白进行对比,G441具有唯一高度保守的独特序列（Gly-Gly-X-Gly图案：Gly丰富序列）。在此序中第二个Gly（G439）蛋白氨基酸是通过氢键与FAD的核糖连接,而第一个（G438）和第三个Gly（G441）蛋白氨基酸的功能仍不清楚。相较于G438和G439性质稳定,不宜突变的特点（尚无G438的突变报告,G439的突变报告也只有一个）,G441却容易突变。且据报,G441关键氨基酸接近FAD辅因子,且对于维持FAD辅因子的构型非常重要。但该蛋白氨基酸的分子和功能研究尚未完成。正因为G441序列的高度保守性,结构和功能的重要性,我们的实验成功表达及纯化了G441突变蛋白,并模拟了VLCAD蛋白分子三维结构图。希望通过研究G441蛋白氨基酸的定点突变,来了解该突变点对VLCAD缺乏症的重要性,以及它与VLCAD蛋白结构和功能的关系,并为临床评估VLCAD缺乏严重程度提供一定的理论依据。据报道,G441蛋白氨基酸突变为天冬氨酸（Aspartic acid, Asp, D）。但考虑结构突变时,所取代的代氨基酸性质会影响WT蛋白的理化水平和致病性,代氨基酸与原氨基酸越相似,影响越小。而在众多的氨基酸中,丙氨酸（Alanine,Ala,A）与Gly结构相似最高,因此我们除了研究G441D突变,也研究了G441突变为Ala。我们的实验发现,G441D和G441A突变蛋白显示均约66.5分子量,与野生型相似。蛋白质测定显示WT蛋白和突变蛋白在数量上无显著差异。我们的实验还发现,大鼠肝脏线粒体VLCAD成熟蛋白中最常见的氨基酸是Gly和Ala（9.8%）,其次是亮氨酸（9.6%）和丝氨酸（7.3%）。通过多个对比序列分析显示,Gly保守的频率为23.33%, Gly的保守残基占整个保守残基的35.89%。Gly是最保守的残基,Asp次之,Gly和Asp结合占所有保守残基50%以上,这与Varfolomeev等人研究相一致。这表明在ACADs家族中,特别是在VLCAD蛋白,Gly残基也发挥了重要作用。Gly是一个非常独特的氨基酸,它以氢作为其侧链而不像其他氨基酸以碳作为侧链,从而使它成为已发现蛋白中序列（20个氨基酸）最短的氨基酸序列。由于它没有任何碳,因此Gly缺乏明显化学功能。然而,氢作为残基的体积非常小,使Gly旋转方便,这意味着Gly的构象具有更多灵活性,能适应严密的空间,进行二级结构的扭转。这种结构的扭转已被认为是最常见的非重复性结构。研究显示,残基位点的非重复结构比重复结构更有意义,提示结构扭转是蛋白质结构的一个重要特点。了解G441突变点,将有助于我们了解β-turns对蛋白结构的影响。我们使用Beta TPred2软件对神经网络和多比执行线进行测试,预测WT蛋白和G441突变蛋白的β-turnS。β-turns预测显示,G441替换成Asp （G441D）造成了β-turns损失,而在WT和G441A突变蛋白β-turns仍保留。这可能是与Asp和Ala的理化特性相关。从结构上分析,我们发现G441位于靠近FAD结合口袋及数个催化亚基残留物相邻的关键地位,并作为β-turns。 ACADs是一种黄素蛋白质,每个同聚体酶包含一个摩尔单位的FAD并呈现为黄色。在本研究中,我们发现纯化的WT蛋白及G441D和G441A突变蛋白仍为黄色。这表明,经过一步法纯化后FAD辅因子仍紧密的结合在VLCAD蛋白上,使我们能进行下一步的活性测量和分子机制研究。WT蛋白光谱有三个峰值,分别为274,374和449nm,其比例为4.86：0.88：1。在450nm的一个显著吸光度是辅酶含黄素酶的约束特点。我们实验的VLCAD蛋白光谱吸收特性类似于Izai等人（高峰值分别为277：377：453nm,比例为3.6：0.86：1）和Souri等人（高峰值分别为280：365：450nm,比例为8：0.9：1）的研究。WT蛋白和突变蛋白的光谱吸收无显著差异。上述结果表明G441不影响VLCAD蛋白与FAD辅因子结合,G441蛋白的突变也没有引起球状构象差异。然而, G441突变成为G441D和G441A后,对C16这种脂肪酸化合物的酶的活性分别下降11%和25%。实验还发现,与WT相比,G441蛋白突变的反应速度显著降低,其KM是突变酶的3-4倍,这说明与WT相比,G441蛋白突变时需要大量的底物才能达到饱和浓度。综上所述,VLCAD缺乏症是一种临床表现严重、预后不良的代谢疾病,而G441突变是VLCAD缺乏的重要原因。深入研究VLCAD蛋白及它突变位点蛋白具有重要意义。本实验使用原核大肠杆菌表达系统成功表达出来WT VLCAD蛋白和G441突变蛋白,并通过一步亲和层析法简单快捷的纯化蛋白,得到了高纯度的蛋白产物。通过实验我们发现,造成G441功能下降的可能机制是G441突变为G441D时,扭曲结构的消失,影响了β-turnS。而G441突变为G441A时,虽然没有扭曲结构的消失,没有影响β-turns,但G441功能同样出现了下降,需要再下一步的实验中进行深入研究,同时也为将来基因诊断和治疗VLCAD缺乏症提供理论基础。1.本实验使用原核大肠杆菌表达系统成功表达出来WT-VLCAD蛋白和G441突变蛋白,并通过一步亲和层析法简单快捷的纯化蛋白,得到了高纯度的蛋白产物。2.G441突变是VLCAD缺乏的重要原因。通过实验我们发现,造成G441功能下降的可能机制是G441突变影响VLCAD蛋白的结构和功能。3.因此,我们推测G441突变可以作为评估VLCAD缺乏的一种指标,同时也为将来基因诊断和治疗VLCAD缺乏症提供理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• TABLE OF CONTENTS
• LIST OF ABBREVIATIONS
• CHAPTER 1.Introduction
• 1.1. Background
• 1.2. Aim and Purpose
• CHAPTER 2.Materials and Methods
• 2.1. Materials
• 2.1.1. Nucleic acids,vector,bacterial strains,enzymes and enzymes buffers
• 2.1.2. Media,buffers,solutions,and reagents
• 2.2. Methods
• 2.2.1. WT rat liver mitochondrial VLCAD protein subcloning
• 2.2.1.1. PCR amplication
• 2.2.1.2. Agarose gel electrophoresis
• 2.2.1.3. DNA extraction from agarose gel
• 2.2.1.4. PCR products purification
• 2.2.1.5. Double restriction digestion of plasmid and PCR products
• 2.2.1.6. Ligation into the PLM1 plasmid expression vector
• 2.2.1.7. Transformation of recombinant pLM1::VLCAD plasmid int #0 TOP10 competent cells for screening purposes
• 2.2.1.8. Single and double restriction digestion of positive recombinant pLM1::VLCAD colony
• 2.2.1.9. Transformation of recombinant pLM1::VLCAD plasmid int #0 E.coli strain BL21（DE3）for expression purposes
• 2.2.2. Construction of mutant-types VLCAD expression plasmids
• 2.2.3. Expression of the wild- and mutant-types VLCAD proteins
• 2.2.4. Purification of the wild- and mutant-typesVLCAD proteins
• 2.2.5. SDS-PAGE gel electrophoresis
• 2.2.6. Determine protein concentration
• 2.2.7. Enzyme activity assays
• CHAPTER 3 RESULT
• 3.1. Recombinant WT pLM1::VLCAD plasmid subcloning
• 3.2. Expression and purification of WT protein
• 3.3. Multiple sequence alignments of various sources VLCAD and ACADs
• 3.4. Three dimensional structure of VLCAD protein
• 3.5. Construction of G441 mutant-types protein
• 3.6. Spectral analyses of wild- and mutant-types protein
• 3.7. Quantization of wild- and mutant-types protein expression
• 3.8. Enzymatic activity assay of wild- and mutant-types protein
• 3.9. Kinetic studies of wild- and mutant-types protein
• CHAPTER 4 DISCUSSION
• 4.1. Sequence-based analysis
• 4.2. Structural-based analysis
• 4.3. Functional-based analysis
• CHAPTER 5.Conclusion
• References
• Review
• REFERENCES
• Acknowledgments