论文摘要
背景阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是以进行性痴呆为主要表现的神经退行性疾病。主要病理学表现为,大脑内老年斑形成、神经元神经纤维缠结、神经元和突触丢失。到目前为止对AD发病的机制研究还不十分清楚。最近研究显示,除了APP、PS和ApoE基因突变参与AD发病过程外,各种各样的环境因素成为导致AD发病的致病因素之一。表观调节机制尤其是组蛋白修饰参与AD发病过程中突触丢失、学习记忆力损伤。组蛋白乙酰化修饰是由组蛋白乙酰化酶（HATs）和组蛋白去乙酰酶（HDACs）动态调节的结果。HDAC2在神经系统的发育及生理过程中起着重要作用,HDAC2主要分布于与学习记忆力形成相关的海马CA1、CA3、DG区域,通过调节突触可塑性相关蛋白和改变神经元回路对学习和记忆力起到负性调节作用。AD患者与同龄人群相比脑组织CA1区域和内嗅皮层的神经元中HDAC2表达量增加,本课题为了探讨AD模型小鼠脑部特异性敲除HDAC2后是否对AD的病理过程产生影响。方法脑组织特异性敲除HDAC2的模型小鼠与APP/PS1双转基因小鼠杂交,获得APP/PS1脑部特异性敲除HDAC2模型小鼠。检测4月龄WT、AD、HDAC2K0和AD-HDAC2KO模型小鼠身长、脑重、体重、脑重比体重系数等指标。免疫组织化学、免疫荧光化学和免疫印迹等方法检测HDAC2在WT、AD、HDAC2KO、AD-HDAC2KO模型小鼠脑组织表达情况。应用开放旷场、新物体识别实验和Morris水迷宫实验检测WT、AD、HDAC2KO及AD-HDAC2KO模型小鼠自主活动的改变和小鼠学习记忆能力的改善情况。免疫组织化学和硫磺素-S染色检测脑内老年斑含量；应用ELISA方法检测小鼠脑内可溶性Aβ40和Aβ42总量；Western blotting检测小鼠脑内APP降解相关蛋白BACE1、PS1、ADAM10、 ADAM17、sAPPα、sAPPβ、β-CTF及α-CTF的表达量；检测突触可塑性相关蛋白PSD95和突触素（Syn）的表达量；检测脑部信号通路分子P-AKT、P-GSK3p及P-CREB的变化。结果4月龄的脑部特异性敲除HDAC2的APP/PS1双转基因小鼠,与WT小鼠相比其体长矮小、体重较轻,而脑重及脑重比体重系数没有差别。免疫组化及免疫荧光结果显示,APP/PS1双转基因小鼠脑部特异性敲除HDAC2后其脑组织中皮层和海马CA1、齿状回DG区域神经元内HDAC2被敲除；同时结合免疫印迹实验结果显示可有效敲除脑部HDAC2。建立脑部特异性敲除HDAC2的APP/PS1模型小鼠,6月龄模型小鼠在旷场实验中的活动量减少,增加新物体识别实验中的识别指数,减少Morris水迷宫定位航行实验中找到平台的潜伏期,并增加空间探索实验中小鼠穿越平台所在象限的次数和停留时间。硫磺素-S荧光染色及免疫组化染色结果显示,脑部特异性敲除HDAC2的APP/PS1模型小鼠海马和皮层老年斑数量及面积均减少。ELISA检测结果显示,敲除HDAC2后能够显著减少脑组织内可溶性Aβ1-40和可溶性Aβ1-42浓度。Western blotting结果显示,敲除HDAC2后可以抑制脑部APP降解过程,降低BACE1、PS1、sAPPβ及CTF的表达,增加sAPPa的表达,而对ADAM10和ADAM17的表达量没有影响,增加突触素的表达,增加P-AKT和P-GSK3β磷酸化水平。结论脑部特异性敲除HDAC2可以改善APP/PS1模型小鼠的病理损伤和学习记忆力。敲除HDAC2可以抑制4PP/PS1模型小鼠脑组织中老年斑的形成,影响APP的降解过程。可以缓解APP/PS1模型小鼠脑组织突触素的降低和抑制GSK3P活性。因此,HDAC2在AD的发病过程中起到重要作用。背景在中枢神经系统中,胰岛素对学习和记忆力的调节起着重要作用。胰岛素受体在脑组织中分布广泛,而在大脑皮层和海马区域分布密度较高。在海马区域胰岛素信号通路参与神经元存活、突触的形成及突触可塑性、树突棘的形成和兴奋性突触的发育。研究显示,Sirtuins是属于NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶Ⅲ家族,SIRT1参与脑组织的能量代谢平衡、突触可塑性、记忆力形成过程等生理过程。然而,胰岛素是否调节中枢神经系统神经元SIRT1的表达,从而影响突触可塑性,这些问题仍然是未知。方法应用MTT方法检测不同浓度胰岛素对SH-SY5Y细胞作用的最适浓度；应用胰岛素信号通路抑制剂LY294002,检测胰岛素是否通过激活PI3K/Akt级联反应调节SIRT1表达；应用Western blotting实验方法检测胰岛素对SH-SY5Y细胞中SIRT1蛋白表达水平的影响；分别应用SIRT1特异性抑制剂和SIRTI-siRNA降低SH-SY5Y细胞中SIRT1表达,检测胰岛素是否通过调节SIRT1表达影响轴突生长。结果胰岛素促进SH-SY5Y细胞轴突生长和上调SIRT1表达水平,并且胰岛素对SIRT1调节具有时间依赖性。胰岛素通过激活PI3K/Akt级联反应调节SIRT1表达影响神经轴突生长。进一步对SH-SY5Y细胞应用SIRT1特异性抑制剂后,影响胰岛素调节轴突生长。此外,对细胞应用SIRT1-siRNA降低细胞内SIRT1表达后,应用胰岛素不能有效增加细胞轴突生长。结论体外研究显示,胰岛素通过激活PI3K/Akt级联反应调节SIRT1蛋白的表达,从而进一步影响轴突生长。