腹腔预处理去细胞光氧化猪主动脉瓣膜制备组织工程瓣膜

论文摘要

第一部分去细胞结合光氧化对猪主动脉瓣膜组织学和生物力学的影响目的：采用去细胞结合染料介导的光氧化法处理猪主动脉瓣膜,寻找合适去细胞方案；评价光氧化交联法对猪主动脉瓣膜的生物力学性能的影响。方法：体外性能的研究：将120个瓣膜随机分为12组,每组10个,通过对瓣膜多步骤的去细胞效果,以及胶原弹力纤维保存的完整性等方面评价,获得去细胞的合适方案；将修剪好的40去细胞猪主动脉瓣膜随机分为4组,每组10个。F组：为新鲜组,置于无菌PBS液中40℃保存备用。DP组：为去细胞结合光氧化处理组,共计三个亚组：DP12h组：为去细胞处理后再进行染料介导的光氧化处理12小时；DP24h组：去细胞后光氧化反应24小时；DP36h组：去细胞后光氧化反应36小时。通过热皱缩温度、组织含水量、最大抗张强度和最大拉伸距离及体外酶降解实验评价光氧化的最理想时间。体内性能研究：得到合适去细胞光氧化方案后,将45个瓣膜分为3组,新鲜组、戊二醛组、去细胞光氧化组。通过热皱缩温度、最大抗张强度和最大拉伸距离评价各瓣膜性能。然后建立大鼠皮下包埋模型,12周后获取组织标本,通过HE染色,比较各组瓣叶的形态结构变化及炎性反应情况；原子吸收光谱法测定组织钙含量,评价光氧化处理对去细胞猪主动脉瓣膜的体内生物稳定性及抗钙化性能影响。结果：采用多步骤去垢剂-酶消化法处理猪主动脉瓣膜,能够有效的去除瓣膜的细胞成分同时保留了完整的细胞外基质成分。第Ⅷ组脱细胞处理后的猪瓣膜比较理想,组织大体形态和新鲜猪瓣膜相似,光镜观察结果显示：细胞成分去除彻底,未见明显细胞残留成分,胶原弹力纤维保存较完整,组织结构无明显疏松。光镜结果显示,经光氧化反应进一步交联后去细胞瓣膜的组织结构将变紧凑,24小时可达最佳效果。机械性能检测显示,光氧化交联去细胞后的瓣膜,其机械性能将逐渐恢复,至光氧化24小时后去细胞猪主动脉瓣膜的机械性能与新鲜组比较无统计学差异（P>0.05）；体外抗酶降解实验结果表明,去细胞光氧化后的猪主动脉瓣膜抗酶解能力相比新鲜的猪主动脉瓣膜有所提高,光氧化处理24小时后的抗酶解能力要优于12小时,与再处理12小时的效果无明显差异（P>0.05）。体内性能研究结果显示,大鼠皮下包埋实验中,新鲜对照组的猪主动脉瓣膜发生了比较严重、广泛的炎性反应,并出现了一定程度的溶解；去细胞光氧化组的炎性反应是所有组别中最轻的。钙含量测定结果显示去细胞光氧化组钙化程度最低,与其它两组有统计学差异（P<0.05）；去细胞光氧化组的生物稳定性要优于新鲜的猪主动脉瓣膜及戊二醛组,瓣叶无明显降解,炎性细胞浸润少且范围局限,组织结构保存较好并有新生血管形成。戊二醛处理组可见明显大片团聚钙化区域,钙含量测定结果与其它两组比较有统计学差异（P<0.05）。结论：1.采用多步骤去垢剂一酶消化法（0.25%曲那通X-100 24h,0.05%胰蛋白酶和0.02%EDTA 10min,30u/m1DNase-Ⅰ和0.3mg、mlRNase-A 12h）是适合猪主动脉瓣膜的较佳脱细胞方案,能够有效去除其细胞成分,同时完整保存胶原纤维及弹力纤维。2.光氧化反应对去细胞猪主动脉瓣膜的交联作用呈时间依赖性,至光氧化反应24小时性能表现最佳。3.相比新鲜猪主动脉瓣膜,去细胞光氧化反应交联的猪主动脉瓣膜脉免疫原性低,生物耐受程度好。而相对戊二醛处理的猪主动脉瓣膜则具有更好的抗钙化性能。4.去细胞结合光氧化处理有可能成为前景广泛、适合于处理猪主动脉瓣膜新型处理方法。第二部分腹腔预处理制备组织工程瓣膜目的：评价腹腔预处理的去细胞光氧化的猪主动脉瓣膜在体内生物学性能及抗栓性能,细胞生长情况。方法：成年狗10只,雌雄不拘,随机分为两组,一组为腹腔预处理组,一组为普通组。去细胞光氧化的猪主动脉瓣膜,植入狗的腹腔内5天,然后取出裁剪成带瓣血管片,吻合到同一只狗的腹主动脉上,2月后取出,普通组是将去细胞光氧化的猪主动脉瓣膜裁剪成带瓣血管片直接吻合到狗的腹主动脉上,2月后取出。观察其细胞生成情况,Ⅷ因子染色和α-SMA免疫组化染色观察其内皮细胞和肌成纤维细胞的生长情况,通过热皱缩温度、最大抗张强度和最大拉伸距离评价其机械性能。结果：两组狗术后均无死亡,大体观察两组带瓣血管片光滑,无血栓形成。Ⅷ因子染色和α-SMA染色显示预处理组的带瓣血管片上有大量的肌成纤维细胞生成,表面有单层排列的内皮细胞,普通组有少量的肌成纤维细胞和散在的内皮细胞生成。机械性能研究显示腹腔预处理组的带瓣血管片热皱缩温度、最大抗张强度和最大拉伸距离明显强于普通组的带瓣血管片p<0.05。结论：去细胞结合光氧化反应处理的猪主动脉瓣膜植入体内后无不良反应,生物稳定性好,无血栓形成腹腔预处理制备的组织工程瓣膜体内能够再细胞化,其机械性能保持好,抗栓性能好。腹腔预处理方法有望成为构建组织工程瓣膜的新途径。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 去细胞结合光氧化对猪主动脉瓣膜组织学和生物力学的影响
• 1. 引言
• 2. 材料和方法
• 3. 结果
• 4. 结论
• 5. 讨论
• 参考文献
• 第二章 腹腔预处理构建组织工程瓣膜的实验研究
• 1. 前言
• 2. 材料和方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 结论
• 参考文献
• 总结
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果