恶臭假单胞杆菌YZ-26中丙氨酸消旋酶结构与功能的研究

论文摘要

丙氨酸消旋酶（alanine racemase） （EC5.1.1.1）是以磷酸吡哆醛（pyridoxal 5’-phosphate, PLP）为辅酶,催化L型和D型丙氨酸之间转化的一种酶。丙氨酸消旋酶广泛分布在原核生物,在枯草杆菌B.subtilis,伤寒沙门氏菌Salm onella typhim urium,埃希氏菌属大肠杆菌Escherich ia coli,粪球链锁状菌Streptococcus faeca lis,假单胞杆菌Pseudomonas及分枝杆菌Mycobacterium等菌种中均有报道。其中,在伤寒沙门氏菌、埃希氏菌属大肠杆菌、假单孢杆菌、霍乱肠弧菌和枯草芽孢杆菌中均存在两种类型的丙氨酸消旋酶,分别命名为DadB （DadX）和Alr。DadB （DadX）是诱导型表达且参与L-丙氨酸的代谢,而Alr为组成型表达,参与D-丙氨酸的合成。本文以假单胞杆菌YZ-26（Pseudomonas putida YZ-26）基因组为模板,设计相应引物进行PCR,得到两种类型的丙氨酸消旋酶基因：Alr与dadX, Alr基因的开放阅读框为1230bp,编码410个氨基酸,预测分子量为44.2kDa, dadX基因的开放阅读框为1074bp,编码358个氨基酸,预测分子量为38.6kDa。序列比对结果显示,Alr的氨基酸序列与Pseudomonas putida KT2440的Alr相似性较高为94.4%,与Pseudomonas aeruginosa、Escherichia coli、Salmonella typhimurium的Alr的氨基酸相似性都比较低,分别为：27.3%、26.9%、27.4%。而DadX的氨基酸序列与Pseudomonas putida KT2440、Pseudomonas aeruginosa、Escherichia coli、Salmonella typhimurium的DadX比较,相似性分别为98.0%、71.1%、46.7%、45.2%。分别将上述两个消旋酶基因克隆到表达载体,构建重组质粒pETM-3c-Alr和pMAL-s-dadX,转入BL21（DE3）中经IPTG诱导后均为可溶性表达。经菌体破碎、Ni-Agarose亲和柱或Amylose亲和柱以及Sephacryl-S-200凝胶层析,获得电泳纯的Alr和融合麦芽糖结合蛋白MBP的MBP-dadX。活性测定表明：Alr不仅对丙氨酸具有消旋作用,而且对异亮氨酸也具有消旋作用,而MBP-dadX只对丙氨酸有消旋作用。对两类丙氨酸消旋酶Alr和MBP-dadX的酶学性质研究结果表明：Alr的Km和Vmax值分别为10.34 mmol/L、18.73μmol/min.mg,而MBP-dadX的Km和Vmax值分别为6.39mmol/L、8.83μmol/min.mg; Alr的最适pH为pH8.0,最适温度为37℃,在pH6.0到pH 12.0间以及4℃到40℃间酶稳定存在；MBP-dadX的最适pH为pH7.0,在pH6.0到pH10.0间酶稳定存在。和dadX相比,Alr有更好的碱性环境耐受性,二价金属离子对酶活性影响实验,揭示1mM的Sr2+、Mn2+、Co2+对两类酶均有激活作用,而Cu2+、Zn2+对丙氨酸消旋酶有较强抑制。Alr蛋白采用坐滴法,利用Hampton Research公司的Crystal ScreenⅠ&Ⅱ和PEG/ION试剂盒进行结晶条件的筛选、优化,确立蛋白浓度为4mg/ml,沉淀剂为25%PEG4000和0.2 M硫胺,缓冲液为0.1M的醋酸钠,pH4.8,温度16℃的条件是最佳结晶条件,最终获得长方形的单晶。在生物物理所平台室内光源（Rigaku R-Axis IV++）Cu靶Kαradiation（λ=1.5418 A）)进行数据收集,衍射率达到2.4（?）。恶臭假单胞杆菌YZ-26丙氨酸消旋酶Alr晶体结构具有典型的a/p桶结构,为同源二聚体,2个单体首尾相接,由1个单体的N端结构域与另1个单体的C端结构域形成,通过一些极性和疏水力来维持其二聚体结构,单个亚基含有383个氨基酸,每个单体含有2个结构域,50～270个残基组成N端结构域,形成1个TIM桶结构,它是酶的活性位点区域,包括β2～β9的p折叠股、α1～α9的α螺旋；由247-381个氨基酸残基组成的C端结构域几乎完全由β折叠股组成。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 丙氨酸消旋酶
• 1.1.1 丙氨酸消旋酶的分布
• 1.1.2 丙氨酸消旋酶的结构
• 1.1.3 丙氨酸消旋酶的作用机制
• 1.1.4 丙氨酸消旋酶与疾病
• 1.1.5 展望
• 参考文献
• 第二章 丙氨酸消旋酶Alr的克隆,表达及活性分析
• 2.1 前言
• 2.2 材料
• 2.2.1 载体和菌株
• 2.2.2 主要的酶和化学试剂
• 2.2.3 主要的仪器设备
• 2.3 方法
• 2.3.1 丙氨酸消旋酶Alr的克隆
• 2.3.2 重组质粒的构建
• 2.3.3 重组Alr的表达与纯化
• 2.3.4 丙氨酸消旋酶的测活体系的构建
• 2.3.5 Alr的分子量测定
• 2.3.6 测定Alr的基本动力学参数
• 2.3.7 温度、pH及二价金属离子对丙氨酸消旋酶Alr的影响
• 2.4 结果及讨论
• 2.4.1 丙氨酸消旋酶Alr的克隆
• 2.4.2 重组质粒的酶切鉴定
• 2.4.3 丙氨酸消旋酶Alr的序列分析
• 2.4.4 以L-Alanine为底物测定Alr的基本动力学参数
• 2.4.6 温度、pH及二价金属离子对丙氨酸消旋酶Alr的影响
• 2.4.7 丙氨酸消旋酶Alr分子量的测定
• 2.4.8 丙氨酸消旋酶Alr的二级结构分析
• 2.5 小结
• 参考文献
• 第三章 丙氨酸消旋酶Alr的结晶以及晶体结构解析
• 3.1 前言
• 3.2 材料
• 3.2.1 载体和菌株
• 3.2.2 主要的酶和化学试剂
• 3.2.3 主要的仪器设备
• 3.3 方法
• 3.3.1 蛋白质晶体学原理
• 3.3.2 晶体学方法
• 3.3.3 丙氨酸消旋酶Alr的晶体条件筛选
• 3.3.4 丙氨酸消旋酶Alr与辅因子PLP的晶体条件筛选
• 3.3.5 Alr晶体数据收集
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 丙氨酸消旋酶Alr晶体生长:采用坐滴法获得用于衍射的晶体
• 3.4.2 Alr结晶过程伴随蛋白的部分降解
• 3.4.3 丙氨酸消旋酶Alr衍射数据收集与处理
• 3.4.4 Alr晶体的整体结构
• 3.4.5 丙氨酸消旋酶Alr与辅因子PLP的晶体筛选
• 3.4.6 Alr+PLP衍射结果
• 3.5 小结
• 参考文献
• 第四章 丙氨酸消旋酶dadX的克隆,表达及活性分析
• 4.1 前言
• 4.2 材料
• 4.2.1 载体和菌株
• 4.2.2 主要的酶和化学试剂
• 4.2.3 主要的仪器设备
• 4.3 方法
• 4.3.1 丙氨酸消旋酶dadX的克隆
• 4.3.2 重组质粒的构建
• 4.3.3 重组蛋白表达与纯化
• 4.3.4 以L-Alanine为底物测定MBP-dadX的基本动力学参数
• 4.3.5 pH及二价金属离子对丙氨酸消旋酶MBP-dadX的影响
• 4.4 结果及讨论
• 4.4.1 丙氨酸消旋酶dadX的克隆
• 4.4.2 重组质粒的酶切鉴定
• 4.4.3 丙氨酸消旋酶dadX的序列分析
• 4.4.4 丙氨酸消旋酶dadX的表达及纯化
• 4.4.5 MBP-dadX的动力学参数
• 4.4.6 pH及二价金属离子对丙氨酸消旋酶MBP-dadX的影响
• 4.5 小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简况及联系方式
• 攻读学位期间取得的研究成果