尾叶桉再生体系的建立及TSRF1基因遗传转化的研究

论文摘要

桉树（Eucalyptus）原产澳洲,桃金娘科常绿阔叶速生乔木,是世界三大速生树种之一,同时也是优良的林业经济植物,主要用于工业纸浆原料、人造板和提炼桉油。尾叶桉U6品种是从尾叶桉实生林中选育出来的优良品系,目前已在广东、广西和海南三省大面积推广造林。它具有速生丰产、第二、三代萌芽力强等优点。随着桉树人工林面积的不断扩大,桉树病虫害问题也越来越突出,病虫害种类不断增加,危害程度愈加严重,严重影响了桉树的正常生长,降低了木材和其他林产品的产量和质量。利用遗传工程改良桉树品种是目前桉树遗传改良研究的一个热门领域,它能有效打破物种间的界限,实现动物、植物和微生物间基因资源的相互利用,并可以实现对目标性状的定向变异,同时能大大缩短育种年限、加快育种进程。但当前桉树生物技术研究仍然存在着很多障碍,如桉树组织培养周期长、体胚发生率低、基因遗传转化效率低等等,这些问题已经成为桉树组织培养、桉树生物技术、桉树功能基因的验证研究等领域的障碍。本研究以尾叶桉U6无性系的种子萌发的下胚轴为外植体,首先建立了该树种的离体快繁及植株再生体系,并就培养条件和植物生长调节剂等因素对尾叶桉下胚轴再生体系的影响进行了详细研究;然后利用NPTⅡ筛选基因对影响根癌农杆菌介导尾叶桉遗传转化的条件做了深入探索,通过优化转化条件,建立了尾叶桉遗传转化体系;最后在已建立的遗传转化体系的基础之上,对农杆菌介导的TSRF1基因转入桉树进行了初步研究。主要研究结果如下:1、建立了尾叶桉高效离体再生体系（1）愈伤组织诱导培养基:MS+2,4-D 0.1 mg/L+6-BA 0.6 mg/L+Vc 100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L（pH 5.8～5.9）,愈伤组织诱导率达96.7%（2）不定芽诱导分化培养基:1/2MS+LC 0.8 mg/L+IBA 0.2 mg/L+TDZ3μmol/L+腐胺500μmol/L+亚精胺50μmol/L+Vc 100 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L（pH 5.8～5.9）,不定芽分化率达到53.3%,优胜芽率为48.3%（3）不定芽伸长培养基:BS+NAA 0.05 mg/L+LC0.8mg/L+Vc 100 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L（pH 5.8～5.9）,2.0cm以上的芽苗达到82.3%（4）芽增殖培养基:1/2MS+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L（pH 5.8～5.9）,芽的月增殖倍数达4.4,芽平均高为2.7cm（5）再生苗生根培养基:1/4 MS+NAA 0.05mg/L+IAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L（pH 5.8～5.9）2、优化了尾叶桉遗传转化体系本文研究了农杆菌介导转化尾叶桉下胚轴的各种影响因素,优化了遗传转化体系。暗处预培养7d、在菌液浓度OD=0.4-0.6的农杆菌中浸泡3h、共培养5d,延迟筛选7d左右为最优化的遗传转化体系。3、获得了TSRF1基因转化的抗性植株采用PCR方法对尾叶桉转化植株进行检测。以未转化的植株为阴性对照,以质粒DNA为阳性对照,以TSRF1特异性引物进行PCR检测,结果表明,转基因植株扩增的条带和质粒中的目的条带一致,而未转化植株没有扩增出任何条带,证实TSRF1基因已经整合到尾叶桉基因组中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 桉树组织培养研究进展
• 1.1 桉树组织培养的意义
• 1.2 桉树组织培养研究进展
• 2 林木抗病基因工程研究进展
• 2.1 林木基因工程
• 2.2 林木抗病基因工程研究进展
• 3 桉树基因工程研究进展
• 4 转录因子在植物防卫反应中的作用
• 5 ERF转录因子研究进展
• 5.1 ERF转录因子的主要结构特征及分类
• 5.2 ERF转录因子在植物防卫反应中的作用
• 5.2.1 ERF转录因子在植物防卫反应信号传递途径中的作用
• 5.2.2 ERF转录因子在提高植物抗病能力中的作用
• 6 TSRF1转录因子研究进展
• 6.1 TSRF1转录因子的特性介绍
• 6.2 TSRF1转录因子的功能介绍
• 7 本研究的目的意义及主要内容
• 7.1 尾叶桉U6再生体系的建立
• 7.2 农杆菌介导桉树转化体系的优化
• 第二章 尾叶桉的组织培养与快速繁殖
• 1 材料
• 3 实验方法
• 3.1 主要植物生长调节剂及培养基基本成分的配制
• 3.1.1 主要植物生长调节剂的配制
• 3.1.2 培养基基本成分的配制方法
• 3.2 实验材料的获得
• 3.3 愈伤组织的诱导
• 3.3.1 苗龄
• 3.3.2 暗处理时间
• 3.3.3 不同浓度的Vc、Ac（活性炭）及PVP
• 3.4 不定芽的诱导及分化
• 3.4.1 诱导不定芽的产生
• 3.4.2 不定芽的伸长
• 3.5 诱导丛生芽的增殖
• 3.5.1 不同激素的选择
• 3.5.2 基本培养基
• 3.6 再生苗的生根与移栽
• 3.6.1 基本培养基及不同激素组合
• 3.6.2 蔗糖
• 3.6.3 移栽
• 4 结果与分析
• 4.1 不同消毒剂及消毒时间对无菌材料的获得的影响
• 4.2 愈伤组织的诱导
• 4.2.1 苗龄对愈伤组织诱导的影响
• 4.2.2 暗处理时间对愈伤组织防褐化的影响
• 4.2.3 不同添加剂对愈伤组织抗褐化的影响
• 4.3 不定芽的诱导及分化
• 4.3.1 诱导不定芽的产生
• 4.3.2 不定芽的伸长
• 4.4 诱导丛生芽的增殖
• 4.4.1 不同激素种类及配比对芽增殖的影响
• 4.4.2 基本培养基对丛生芽增殖的影响
• 4.5 再生苗的生根及移栽
• 4.5.1 不同浓度的IBA对生根的影响
• 4.5.2 不同浓度的NAA与IAA组合对生根的影响
• 4.5.3 蔗糖浓度对生根的影响
• 5 讨论
• 5.1 光照对无菌苗继代增殖的影响
• 5.2 褐化问题的探讨
• 5.2.1 影响褐化的因素
• 5.2.2 控制褐化的措施
• 5.2.3 本研究对褐化控制的探讨
• 5.3 玻璃化的探讨
• 5.3.1 影响玻璃化的因素
• 5.3.2 控制玻璃化的措施
• 5.3.3 本研究对玻璃化控制的探讨
• 5.4 关于LC运用的探讨
• 5.5 多胺对尾叶桉下胚轴不定芽分化与伸长的影响
• 5.6 生根
• 5.7 炼苗
• 6 小结
• 7 附图
• 第三章 TSRF1基因导入桉树的研究
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌种与质粒
• 1.3 试验用基本培养基
• 1.3.1 农杆菌培养基
• 1.3.2 遗传转化基本培养基
• 1.4 主要试剂及其配制
• 2 方法
• 2.1 尾叶桉抗生素敏感性实验
• 2.1.1 卡那霉素（Kan）抑制桉树下胚轴不定芽分化实验
• 2.1.2 卡那霉素（Kan）抑制桉树生根实验
• 2.1.3 头孢霉素（Cef）耐性实验
• 2.1.4 头孢霉素（Cef）抑制农杆菌实验
• 2.2 农杆菌中目的基因的检测
• 2.2.1 农杆菌质粒提取
• 2.2.2 PCR检测目的基因
• 2.3 农杆菌介导的尾叶桉遗传转化体系的建立
• 2.3.1 工程菌液的制备
• 2.3.2 遗传转化参数的优化
• 2.3.3 转化方法
• 2.4 转化植株的分子检测
• 2.4.1 CTAB法小量提取辣椒基因组总DNA
• 2.4.2 PCR检测目的基因
• 3 实验结果
• 3.1 尾叶桉抗生素敏感性实验
• 3.1.1 卡那霉素选择压的确定
• 3.1.2 头孢霉素对桉树下胚轴不定芽诱导的影响
• 3.1.3 头孢霉素对农杆菌的抑制作用
• 3.2 PCR检测质粒中的目的基因
• 3.3.1 预培养时间对转化的影响
• 3.3.2 农杆菌菌液浓度对转化的影响
• 3.3.3 侵染时间对转化的影响
• 3.3.4 共培养时间对转化的影响
• 3.3.5 农杆菌介导尾叶桉遗传转化体系的建立
• 3.3.6 转基因植株的PCR检测
• 4 讨论
• 4.1 影响桉树转化的因素
• 4.2 影响桉树抗生素敏感性试验的因素
• 4.3 预培养时间对转化的影响
• 4.4 侵染时间对转化的影响
• 4.5 共培养时间对转化的影响
• 4.6 延迟筛选对转化的影响
• 4.7 关于检测方法的比较
• 4.8 关于假转化体和基因沉默
• 本研究的主要创新点及下一步工作设想
• 参考文献
• 缩略表
• 致谢
• 作者简介