人肠道菌群PCR-DGGE方法的建立及脾虚患者的研究

论文摘要

脾虚证是临床常见的一类中医证候,是慢性消化系统疾病的主要证型。研究证实,脾虚证与肠道菌群的变化密切相关。本研究通过对健康受试者和临床脾虚证患者肠道菌群研究,考察年龄和性别对健康人群肠道菌结构变化的影响以及脾虚证与肠道菌群的关系,初步建立脾虚证的肠道菌群分子特征,为进一步深刻理解中医“脾虚证”的实质和脾虚证的临床诊断提供新的思路和方法。本研究采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)及变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)技术构建人肠道菌群16S rDNA指纹图谱,并对其分析方法进行了优化。在此基础上,分别比较了不同年龄和不同性别的健康人群肠道菌结构的差异,以及健康人群和老年男性脾虚证患者(脾阳虚、脾气虚、脾阳虚兼脾气虚)肠道菌群基因指纹图谱的差异。通过对脾虚证特征条带指认以及健康人群与脾虚证患者之间、不同类型脾虚证患者(脾阳虚、脾气虚、脾阳虚兼脾气虚)间肠道菌结构的相似性分析(包括非加权配对算术平均法聚类分析、多维尺度分析和主成分分析)的方法确定脾虚证患者肠道菌群基因指纹特征,从而揭示脾虚证与肠道菌群的关系。结果表明,性别差异不会造成肠道菌群结构明显差异,而年龄差异则与肠道菌群的结构改变有一定关联。脾阳虚、脾气虚和脾阳虚兼脾气虚患者的肠道菌群结构具有明显差异,非加权配对算术平均法聚类分析、多维尺度分析和主成分分析均能对其按肠道菌群结构差异进行区分,与临床诊断结果基本一致。经比较初步确定脾虚证患者16S rDNA DGGE特征条带1条,2条脾阳虚患者差异性特征条带和1条脾气虚患者差异性特征条带。此外同一证侯组中不同病症、临床表征和病程的患者肠道菌群结构明显不同。诊断为肠易激综合症(mS)的脾虚患者与诊断为非肠易激综合症(包括诊断为其它消化系统疾病和非消化系统疾病)的脾虚患者的菌群结构有明显差异；临床表征相似的脾虚患者肠道菌群结构也较为相似；而病程相差悬殊的脾虚患者,其肠道菌群结构也有明显差异。综上,肠道菌群的基因指纹图谱能较全面的反映肠道菌群的整体变化状况,具有同期性。本研究通过采用优化的16S rDNA DGGE指纹图谱分析方法对脾虚证患者肠道菌群变化进行研究,使脾虚证诊断标准进一步客观化、标准化,体现现代生物技术与传统中医相结合的理论和应用价值。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 绪论
• 1 脾虚证
• 1.1 脾气虚证
• 1.2 脾阳虚证
• 1.3 脾气虚与脾阳虚关系
• 1.4 脾虚证与肠道菌群的关系
• 2 肠道菌群及其研究方法
• 2.1 肠道菌群的作用
• 2.2 肠道菌群的研究方法
• 2.2.1 传统方法
• 2.2.2 分子生物学方法
• 3 变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术
• 4 课题意义
• 第二章 人肠道菌群16S rDNA DGGE分析方法的建立
• 1 实验材料及仪器
• 1.1 实验样品
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 肠道菌群总DNA提取
• 1) 传统酚/氯仿法
• 2) 试剂盒法
• 2.2 DNA质量检测
• 2.3 PCR扩增程序
• 2.4 PCR扩增体系
• 2.5 16S rDNA产物检测
• 2.6 DGGE分析
• 1) 制胶
• 2) 电泳时间
• 3) 变性剂梯度范围
• 4) 银染方法
• 3 结果
• 3.1 总DNA提取方法考察
• 3.2 16S rDNA-PCR DGGE扩增程序和扩增体系组成
• 3.3 电泳时间的确定
• 3.4 变性剂梯度范围考察
• 3.5 银染方法考察
• 4 结论与讨论
• 第三章 健康人粪便肠道菌群16S rDNA DGGE分析
• 1 实验材料及仪器
• 1.1 实验样品
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要实验仪器
• 2 方法
• 2.1 总DNA提取
• 2.2 DNA质量检测
• 2.3 16S rDNA V3区扩增反应
• 2.4 16S rDNA PCR产物的检测
• 2.5 DGGE分析
• 2.6 数据处理
• 2.6.1 UPGMA聚类分析
• 2.6.2 多维尺度分析（MDS）
• 2.6.3 主成分分析（PCA）
• 3 结果
• 3.1 健康人群粪便肠道菌群16S rDNA V3区DGGE图谱分析
• 3.2 健康人群粪便肠道菌群16S rDNA V3区UPGMA聚类分析
• 3.3 健康人群粪便肠道菌群16S rDNA V3区多维尺度分析（MDS）
• 3.4 健康人群粪便肠道菌群16S rDNA V3区主成分分析（PCA）
• 4 结论与讨论
• 第四章 老年男性脾虚患者肠道菌群16S rDNADGGE分析
• 1 实验材料及仪器
• 1.1 实验样品
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要实验仪器
• 2 方法
• 2.1 总DNA提取
• 2.2 DNA质量检测
• 2.3 16S rDNA V3区扩增反应
• 2.4 16S rDNA PCR产物的检测
• 2.5 DGGE分析
• 2.6 数据处理
• 3 结果
• 3.1 脾虚患者粪便肠道菌群16S rDNA V3区DGGE图谱分析
• 3.2 脾虚患者粪便肠道菌群16S rDNA V3区UPGMA聚类分析
• 3.3 脾虚患者粪便肠道菌群16S rDNA V3区多维尺度分析（MDS）
• 3.4 脾虚患者粪便肠道菌群16S rDNA V3区主成分分析（PCA）
• 4 结论与讨论
• 结论与展望
• 参考文献
• 缩略语表
• 附录
• 致谢
• 个人简历