转Bt cry1Ah基因玉米对蜜蜂的安全性研究

论文摘要

蜜蜂是公认的有益昆虫,具有经济和生态重要性,既能提供有益的蜂产品又能为植物授粉。对提高农作物产量、改善产品品质和维持生态平衡具有十分重要的作用。近年来世界范围内蜜蜂大量减少,杀虫剂中毒是导致蜂群下降的主要原因之一。转基因抗虫植物的发展,为害虫防治提供了一条新思路,减少了杀虫剂的使用。新型杀虫蛋白基因cry1Ah基因是中国农业科学院植物保护研究所从Bt菌株BT8中鉴定克隆的,其编码蛋白对鳞翅目害虫具有强毒力,尤其对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）的毒力强于目前使用的cry1A类基因。转cry1Ah基因基因抗虫玉米具有很好的应用前景。因此,开展转cry1Ah基因玉米对蜜蜂的安全性研究很有必要。本文从农业生态系统的角度出发通过毒蛋白的实验室测验、Bt玉米花粉饲喂蜂群幼虫试验和更接近实际农业生态条件的大田网室试验,测定转Bt cry1Ah基因玉米对蜜蜂的直接影响;并测定了Cry1Ah毒素对蜜蜂敌害大蜡螟的毒性以及螨害蜜蜂对毒素敏感性的改变,并且以一些化学杀虫剂为阳性对照研究其对蜜蜂的致死亚致死效应。具体结果如下:1、在实验室将接近Bt玉米花粉中表达量浓度1 ng/ml、10 ng/ml和不现实的高浓度10000 ng/ml Cry1Ah毒素混入糖水中饲喂蜜蜂工蜂,测定Cry1Ah毒素对意大利蜜蜂和中华蜜蜂存活、寿命、花粉取食量、王浆腺重量和学习行为的影响。结果显示三种浓度Cry1Ah毒素对意大利蜜蜂和中华蜜蜂工蜂的存活、寿命、花粉取食量和王浆腺重量未见不利影响。取食含10000 ng/ml Cry1Ah毒素糖水的意大利蜜蜂对30%蔗糖水的PER响应水平较对照低,而且对学习行为有不利影响。2、通过解剖工蜂大脑,培养获得大量分离的蜜蜂脑神经细胞,利用膜片钳技术全细胞记录模式研究Bt毒素对蜜蜂脑神经细胞兴奋性的影响。Bt毒素在10ng/ml和100ng/ml浓度下短时间（3-5min）条件下对蜜蜂脑神经元的阈电流没有显著改变,表明对脑神经细胞兴奋性没有显著影响。3、给意大利蜜蜂和中华蜜蜂蜂群中4-6日龄幼虫饲喂转基因玉米花粉、常规玉米花粉、杂花粉、以及哺育蜂饲喂,转基因玉米花粉对封盖率、出房率、发育成功率和发育历期没有显著影响,表明转cry1Ah基因玉米花粉对意大利蜜蜂和中华蜜蜂幼虫的存活和发育没有不良影响。以联苯菊酯和溴氰菊酯作为阳性对照,通过饲喂的方式测定了这两种杀虫剂对蜜蜂的亚致死效应,结果表明联苯菊酯和溴氰菊酯显著降低了发育成功率,延长了发育历期。4、通过大田网室试验测定在实际田间条件下转cry1Ah基因玉米对意大利蜜蜂的风险。意大利蜜蜂蜂群在扬花期分别放入种植转基因玉米和常规玉米的网室中,测定对蜂群存活、发育和行为的影响。结果显示,Bt玉米对发育历期、工蜂存活、蜜蜂体重、王浆腺重量、群势、采集行为和嗅觉学习行为均无不利影响。5、通过饲喂含毒素糖水的方法在实验室探讨了Cry1Ah毒素对螨害蜜蜂的影响。1 ng/ml、10 ng/ml和10000 ng/ml三种浓度Cry1Ah毒素对螨害蜜蜂的存活没有显著影响。与此同时开展了Cry1Ah毒素对蜜蜂敌害大蜡螟（Galleria mellonella）的致死效应研究。结果表明大蜡螟幼虫取食含有Cry1Ah毒素的人工饲料,其死亡率较对照组高。Cry1Ah毒素可作为一种可能的防治大蜡螟的措施。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 蜜蜂概述
• 1.1.1 蜜蜂种类
• 1.1.2 蜜蜂生物学特性
• 1.1.3 蜜蜂的生态重要性
• 1.1.4 化学杀虫剂的大量使用导致蜜蜂种群数量下降
• 1.2 转基因植物概况及Bt简介
• 1.2.1 转基因植物现状
• 1.2.2 转基因玉米现状
• 1.2.3 Bt概述
• 1.3 转Bt植物对蜂类的安全性评价
• 1.3.1 转Bt植物对蜜蜂的安全性评价
• 1.3.2 对熊蜂的影响
• 1.3.3 对独栖蜜蜂的影响
• 1.4 膜片钳技术
• 1.4.1 膜片钳技术简介
• 1.4.2 膜片钳技术在昆虫研究中的应用
• 1.5 本研究的目的意义
• 1.6 技术路线
• 第二章 Bt Cry1Ah毒素对意大利蜜蜂和中华蜜蜂的影响
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 Bt毒素
• 2.1.2 转cry1Ah基因玉米花粉中Bt蛋白含量测定
• 2.1.3 吡虫啉对意大利蜜蜂毒力测定
• 2.1.4 新出房蜜蜂工蜂准备
• 2.1.5 工蜂存活和花粉消耗
• 2.1.6 王浆腺称重
• 2.1.7 学习行为
• 2.1.8 统计方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 花粉中Bt蛋白含量
• 2.2.2 吡虫啉对意大利蜜蜂的毒力测定
• 2.2.3 Cry1Ah毒素对蜜蜂存活率的影响
• 2.2.4 Cry1Ah毒素对蜜蜂寿命的影响
• 2.2.5 Cry1Ah毒素对蜜蜂花粉取食量的影响
• 2.2.6 Cry1Ah毒素对蜜蜂王浆腺重量的影响
• 2.2.7 Cry1Ah毒素对蜜蜂学习行为的影响
• 2.3 讨论
• 第三章 Bt毒素对意大利蜜蜂脑神经细胞电生理的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 细胞培养用试剂
• 3.1.2 主要试剂配制方法
• 3.1.3 实验器械
• 3.1.4 意大利蜂脑神经细胞培养
• 3.1.5 电生理记录
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 成年蜜蜂神经细胞的分离培养
• 3.2.2 Bt毒素对成年意蜂脑神经细胞兴奋性的影响
• 3.3 讨论
• 第四章 Bt cry1Ah基因玉米花粉对意大利蜜蜂和中华蜜蜂的影响
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 试验处理
• 4.1.3 存活与发育观察
• 4.1.4 统计方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 室内毒力测定
• 4.2.2 转cry1Ah基因玉米花粉对未成熟期蜜蜂存活率的影响
• 4.2.3 转cry1Ah基因玉米花粉对蜜蜂发育历期的影响
• 4.3 讨论
• 第五章 大田网室条件下转Bt cry1Ah基因玉米对意大利蜜蜂的影响
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 网室
• 5.1.2 试验蜂群设置
• 5.1.3 发育历期
• 5.1.4 工蜂存活
• 5.1.5 蜜蜂体重
• 5.1.6 群势
• 5.1.7 王浆腺重量
• 5.1.8 采集行为
• 5.1.9 学习行为
• 5.1.10 统计方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 转cry1Ah基因玉米对蜜蜂发育历期的影响
• 5.2.2 转cry1Ah基因玉米对工蜂存活的影响
• 5.2.3 转cry1Ah基因玉米对工蜂体重的影响
• 5.2.4 转cry1Ah基因玉米对群势的影响
• 5.2.5 转cry1Ah基因玉米对蜜蜂王浆腺的影响
• 5.2.6 转cry1Ah基因玉米对蜜蜂采集行为的影响
• 5.2.7 转cry1Ah基因玉米对蜜蜂学习行为的影响
• 5.3 讨论
• 第六章 Bt Cry1Ah毒素对螨害蜜蜂和大蜡螟的研究初探
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 Bt毒素
• 6.1.2 蜜蜂准备
• 6.1.3 大蜡螟的人工饲养
• 6.1.4 Cry1Ah毒素对螨害蜜蜂存活的影响
• 6.1.5 Cry1Ah毒素对大蜡螟存活的影响
• 6.1.6 统计方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 Cry1Ah毒素对螨害蜜蜂存活和寿命的影响
• 6.2.2 Cry1Ah毒素对大蜡螟存活的影响
• 6.3 讨论
• 第七章 全文结论
• 7.1 结论
• 7.2 本研究的创新之处
• 7.3 有待进一步开展的工作
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介