论文摘要
我国是食管癌高发国家,发病人数约占全世界50%以上。临床就诊的食管癌病人多数为中晚期,已失去手术机会或无法根治性手术切除,需要接受放射治疗（放疗）,放疗已成为中晚期食管癌主要治疗方法之一。食管鳞癌属于中度放射敏感性肿瘤,单纯放疗后5年生存率较低,肿瘤局部未控和复发率很高,如何增加食管癌细胞的放射敏感性,提高肿瘤局部控制率、减少复发而提高疗效,始终是研究的热点和难题。细胞周期和放射敏感性有着密切的关系,细胞周期检测点严格控制细胞周期进程。当放射线照射正常和肿瘤细胞后,其作用的主要靶分子DNA发生损伤,激活细胞周期检测点引起细胞周期阻滞,并激活DNA损伤修复系统,促进损伤DNA修复。细胞周期检测点激酶MDC1和53BP1在细胞周期调控方面发挥着重要的作用,它们对体细胞的正常生长没有明显的调节作用,但在DNA损伤修复的信号传导过程中作用非常重要,在DNA损伤发生后激酶立即被激活,并通过激活下游调节通路,主要调节S期和/或G2/M期检测点。近年来研究发现MDC1和53BP1在多种正常组织和肿瘤细胞中有表达,并且与放射线照射后细胞周期阻滞有关,抑制MDC1和53BP1激活或蛋白表达,可有效地消除肿瘤细胞在放射线照射后的细胞周期阻滞,增加对放射线的敏感性。但在食管癌细胞中MDC1和53BP1蛋白表达情况如何、照射后对细胞周期检测点如何调节,目前国内尚未见相关报道。为此,本研究首先采用不同方法观察并检测了人食管癌不同细胞系中MDC1和53BP1的蛋白表达情况,观察并检测了体外培养的食管癌细胞在不同的剂量-时间条件下放射线对细胞周期、MDC1和53BP1的蛋白表达和细胞核内斑点形成的影响,同时观察了药物wortmannin（以下简称WT）对放射线的增敏作用;其次,通过脂质体介导、质粒连接MDC1和53BP1短发卡状RNA（shRNA）、病毒包装及感染技术,成功构建了人食管癌细胞基因MDC1和53BP1蛋白低表达的稳转细胞株;最后,通过体外实验探讨食管癌细胞被转染前后,MDC1、53BP1、CHK1和CHK2蛋白表达及细胞核内斑点形成的变化以及照射对细胞周期的影响;体内实验研究转染对下游相关效应蛋白表达的影响,并通过观测荷瘤裸鼠经放射线照射后瘤体积的变化,从活体水平来评价转染对放射线的增敏作用,为基因治疗联合放射治疗的临床应用提供理论基础和实验依据。第一部分电离辐射对食管癌细胞细胞周期及细胞周期检测点激酶MDC1和53BP1表达的影响目的:观察不同食管癌细胞系中MDC1和53BP1的表达情况;观察体外培养的食管癌细胞株TE-13和ECA109细胞照射后细胞周期、MDC1和53BP1蛋白表达和细胞核内斑点数量的变化,了解食管癌细胞中MDC1和53BP1对照射后细胞周期的调控作用。方法:在人食管癌细胞株TE-1、TE-13和ECA109细胞中,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测MDC1和53BP1mRNA表达,免疫组织化学法、western blotting和流式细胞技术（FCM）间接免疫荧光法检测MDC1和53BP1蛋白表达;采用克隆形成试验和MTT法分别检测WT对食管癌细胞TE13和ECA109的放射增敏作用,FCM检测单纯照射后细胞周期变化,western blotting检测食管癌细胞TE13和ECA109中MDC1和53BP1蛋白表达,激光共聚焦显微镜观察放射线照射后食管癌细胞ECA109中MDC1和53BP1细胞核内斑点的形成。结果:①TE-1、TE-13和ECA109食管癌细胞中MDC1和53BP1在mRNA和蛋白上均有表达,不同食管细胞系之间MDC1和53BP1的表达未见明显差异（P>0.05）。②TE-13细胞照射后12h、24h、48 h,TE-13细胞的G0/G1期、G2/M期和S期的变化呈现明显剂量依赖性,1Gy和2Gy照射后12h,细胞G2/M期阻滞开始出现;5、10、15Gy照射后24h,细胞G2/M期阻滞最为明显,与对照组（0Gy组）相比,差异具有显著性（P<0.05）;15Gy照射后12h、24、48h,TE-13细胞的凋亡增加非常显著（P<0.01）;不同剂量照射后1、2、24h,TE-13细胞MDC1和53BP1蛋白表达未见明显变化（P>0.05）。③细胞照射后1h,各剂量组的MDC1和53BP1核内斑点的数量明显增多,与对照组比较差别具有统计学意义（p<0.05）;各剂量组之间53BP1核内斑点的比较具有统计学差异（p<0.05）;除4Gy和6Gy外,其余各剂量组之间MDC1核内斑点的比较也具有统计学差异（p<0.05）;细胞受照射后,细胞核内均出现镜下可见的核内斑点,且与对照组比较差别具有统计学意义（p<0.05）;除照射后15分钟和1小时之间、照射后1小时和2小时之间的MDC1核内斑点外,其余各时间点的比较具有统计学意义（p<0.05）,而且细胞受照射后30分钟,细胞核内的斑点数量最多（26.3个）。细胞受照射后,细胞核内均出现镜下可见的53BP1核内斑点,且与对照组比较差别具有统计学意义（p<0.05）;除照射后15分钟和1小时之间、照射后1小时和2小时之间的MDC1核内斑点外,其余各时间点的比较具有统计学意义（p<0.05）,而且细胞受照射后1小时,细胞核内的斑点数量最多（36.7个）。结论:食管癌不同细胞系中均有MDC1和53BP1蛋白表达;5Gy照射后食管癌细胞出现G2期阻滞,细胞周期阻滞在较低剂量照射后消退较快,而在较高剂量照射后消退较慢,而且受到的放射线剂量越高,凋亡出现的时间越早;单纯照射不影响TE13和ECA109食管癌细胞MDC1和53BP1蛋白表达水平;但MDC1和53BP1蛋白在细胞核内形成的斑点在照射后一定时间内呈现动态变化,而且细胞核内斑点的数量与剂量和照射后时间存在明显的量效关系。第二部分MDC1和53BP1基因shRNA慢病毒载体构建及稳定转染食管癌细胞株的建立及鉴定目的:通过筛选人食管癌细胞ECA109中人基因MDC1和53BP1蛋白低表达的稳定转染细胞株,观察人食管癌细胞株ECA109细胞周期调控蛋白MDC1和53BP1在mRNA、蛋白质水平上表达的变化,为进一步探讨抑制MDC1和53BP1基因的蛋白表达对食管癌ECA109细胞放射敏感性的影响提供前提条件。方法:根据MDC1和53BP1 mRNA序列,选择三个19nts的靶序列,设计并合成包含正、反义序列的互补DNA链,同时设计一个无义对照序列。退火后插入pSIH1载体的H1RNA启动子后产生pSIH1-MDC1- shRNA1、pSIH1-MDC1- shRNA2、pSIH1-MDC1- shRNA3和pSIH1-53BP1- shRNA1、pSIH1-53BP1- shRNA2、pSIH1-53BP1- shRNA3和pSIH1-negative;以上质粒均经过PCR和测序鉴定。鉴定正确后,转染ECA109细胞,采用Real-Time PCR的方法检测MDC1和53BP1mRNA,比较三种特异性质粒的RNA干扰效果;筛选RNA干扰效果最显著的质粒,将其中干扰效果最好的质粒与慢病毒包装质粒混合物共同转染293T细胞48h后,收集上清并过滤即为病毒液,该病毒液感染ECA109细胞48h后在荧光显微镜下挑取出现绿色荧光的目的克隆,并采用Real-Time PCR和western blotting的方法对稳转细胞株中基因MDC1和53BP1的干扰效果进行鉴定。结果:①成功地将MDC1和53BP1shRNA与pSIH1-H1-copGFP质粒连接、并经细菌转化扩增后,提取质粒DNA;②MDC1和53BP1 shRNA转染ECA109细胞后,其mRNA表达水平均明显下降,pSIH1-MDC1- shRNA1、pSIH1-MDC1- shRNA2、pSIH1-MDC1- shRNA3和pSIH1-53BP1- shRNA1、pSIH1-53BP1-shRNA2、pSIH1-53BP1-shRNA3较空白对照组分别下降了68%、78%、61%和81%、74%、65%;③pSIH1-MDC1- shRNA2、pSIH1-53BP1- shRNA1和慢病毒包装质粒混合物共同转染293T细胞48h后,收集上清并过滤为病毒液,该病毒液感染ECA109细胞48h后,在荧光显微镜下出现绿色荧光,挑取带有绿色荧光的细胞克隆,扩大培养,即为人基因MDC1和53BP1蛋白低表达的食管癌稳定转染细胞株;④对筛选出的稳转细胞株采用Real-Time PCR和western blotting方法进行鉴定,结果发现基因MDC1蛋白低表达的稳定转染细胞株在mRNA和蛋白水平上分别下降了66%和58%,基因53BP1蛋白低表达的稳定转染细胞株在mRNA和蛋白水平上分别下降了65%和52%。结论:采用质粒连接的MDC1和53BP1 shRNA转染ECA109细胞后,其mRNA的表达均明显被抑制,成功构建MDC1和53BP1shRNA表达载体pSIH1-MDC1、pSIH1-53BP1;成功筛选出人基因MDC1和53BP1蛋白低表达的食管癌稳转细胞株;为通过阻断MDC1和53BP1基因表达调控食管癌放射敏感性的研究奠定了基础。第三部分RNA干扰对食管癌细胞CHK1和CHK2表达以及照射后细胞周期的影响目的:观察采用RNA干扰技术降低食管癌细胞中基因MDC1和53BP1的蛋白表达后,对食管癌细胞中下游周期调节蛋白CHK1和CHK2的蛋白表达和细胞核内斑点形成以及照射后细胞周期改变的影响。方法:①采用MTT法和克隆形成实验分别检测了ECA109、ECA109-N、ECA109-M及ECA109-B食管癌细胞之间细胞增殖和放射敏感性之间的差别;②采用流式细胞技术检测5Gy的放射线照射后1h、2h、12h、24h和48h,ECA109、ECA109-N、ECA109-M及ECA109-B细胞周期和凋亡的变化;③采用western blotting检测CHK1和CHK2蛋白表达、激光共聚焦显微镜检测细胞核内MDC1和53BP1斑点形成的变化。结果:①MDC1和53BP1转染对食管癌细胞ECA109的增殖没有明显影响,p>0.05。②照射后1～2h,ECA109、ECA109-N、ECA109-M及ECA109-B细胞G0/G1期、G2/M期和S期的百分率没有明显变化。照射后12h,ECA109、ECA109-N、ECA109-M及ECA109-B细胞的G0/G1期的百分率均较未照射组降低（p<0.05）,而且受照射后,ECA109、ECA109-N组细胞的G0/G1期比例下降比ECA109-M及ECA109-B细胞明显（p<0.05）,细胞未受照射时,ECA109、ECA109-N、ECA109-M及ECA109-B组之间细胞G2/M期的比例没有明显差异（p>0.05）,当细胞受照射后,ECA109-M及ECA109-B组细胞G2/M期的比例明显低于ECA109、ECA109-N组（p<0.05）,ECA109-M及ECA109-B组细胞S期的比例明显高于ECA109、ECA109-N组（p<0.05）,各组细胞之间的凋亡变化没有明显的差别（p>0.05） ;细胞受照射后24h,ECA109、ECA109-N、ECA109-M及ECA109-B细胞的G0/G1期的百分率均较未照射组下降,差异具有统计学意义（p<0.05）,而且受照射后,ECA109、ECA109-N组细胞的G0/G1期比例下降比ECA109-M及ECA109-B细胞明显,差异均有统计学意义（p<0.05）;细胞未受照射时,ECA109、ECA109-N、ECA109-M及ECA109-B组之间细胞G2/M期的比例没有明显差异（p>0.05）,当细胞受照射后,ECA109-M及ECA109-B组细胞G2/M期的比例明显低于ECA109、ECA109-N组（p<0.05）;各组细胞之间的S期和凋亡的变化没有明显的差别（p>0.05）;细胞受照射后48h,ECA109、ECA109-N、ECA109-M、ECA109-B未照射组以及ECA109-M、ECA109-B照射组之间细胞G0/G1期的百分率无明显变化（p>0.05）,但高于ECA109、ECA109-N照射组细胞的G0/G1期百分率（p<0.05）;细胞未受照射时,ECA109、ECA109-N、ECA109-M及ECA109-B组之间细胞G2/M期的比例没有明显差异（p>0.05）,ECA109、ECA109-N、ECA109-M及ECA109-B照射组细胞的G2/M期的百分率高于未照射组（p<0.05）,而ECA109-M及ECA109-B组细胞G2/M期的比例低于ECA109、ECA109-N组（p<0.05）;各组细胞之间的S期的变化没有明显的差别（p>0.05）;ECA109、ECA109-N照射组细胞的凋亡率高于ECA109-M、ECA109-B照射组及未照射组细胞的凋亡率,差别具有统计学意义（p<0.05）。③通过克隆形成实验检测了ECA109、ECA109-N、ECA109-M及ECA109-B食管癌细胞株的放射敏感性。结果显示ECA109细胞的的接种效率为64.8%,ECA109细胞的D0值为3.06Gy,SF2值为0.91;ECA109-N、ECA109-M、ECA109-B细胞的的D0值分别为2.90Gy、1.88 Gy、2.07 Gy;SF2值分别为0.89、0.84、0.79,ECA109-M、ECA109-B细胞的放射敏感性高于ECA109-N、ECA109（p<0.05）。④5Gy照射后1、2h、12h、24h和48h,ECA109、ECA109-N、ECA109-M、ECA109-B食管癌细胞中CHK1、CHK2的蛋白表达变化未见明显变化（p>0.05）;在细胞受照射后1～24h,ECA109-M、ECA109-B组的CHK2T68蛋白表达低于ECA109、ECA109-N组（p<0.05）,而在照射后48h,ECA109、ECA109-N、ECA109-M、ECA109-B之间的CHK2T68蛋白表达无明显差异（p>0.05）。⑤ECA109、ECA109-N、ECA109-M、ECA109-B食管癌细胞接受4Gy放射线照射后1h,ECA109-M、ECA109-B组中的MDC1、53BP1核内斑点的数量明显减少且与对照组比较差别具有统计学意义（p<0.05）。结论:食管癌细胞ECA109-M、ECA109-B的放射敏感性高于ECA109-N、ECA109,提示转染对ECA109细胞具有放射增敏作用;5Gy照射后12小时以后,食管癌细胞ECA109-M、ECA109-B的G2期阻滞明显消除; ECA109-M、ECA109-B细胞接受5Gy放射线照射后,对下游蛋白CHK1和CHK2表达没有明显影响,但对CHK2-T68磷酸化水平具有明显抑制作用,而且细胞核内MDC1和53BP1斑点的形成明显减少。第四部分慢病毒介导的RNAi抑制MDC1和53BP1基因对食管癌细胞体内放射增敏作用研究目的:研究抑制基因MDC1和53BP1的蛋白表达对裸鼠移植瘤的影响,并观察各组裸鼠肿瘤病理组织学和细胞生物学特征的变化,为以RNA干扰MDC1和53BP1蛋白表达为基础的基因治疗联合放射治疗食管癌提供理论依据。方法:①使用已转染MDC1和53BP1的ECA109细胞,建立裸鼠移植瘤模型（ECA109-M和ECA109-B）;②使用转染阴性对照组的ECA109细胞,建立裸鼠移植瘤模型（ECA109-N）;③使用未转染的ECA109细胞,建立裸鼠移植瘤模型（ECA109）,上述各组又分为照射组和非照射组两个亚组;④观察各组裸鼠移植瘤照射后的生长情况,移植瘤体积变化情况,应用western blotting检测移植瘤组织中CHK1、CHK2和CHK2T68的表达,用流式细胞仪分析裸鼠肿瘤组织中细胞周期分布和细胞凋亡结果:①所有接种裸鼠均成活并有肿瘤形成,接种点无红肿破溃,接种后一周左右可见所有裸鼠的爪下形成移植瘤,而且各组之间肿瘤大小无明显差异（p>0.05）;②当接受15Gy的放射线照射后,单纯照射组和空载照射组裸鼠的肿瘤生长速度慢于未照射组（p<0.05）,MDC1转染联合照射组和53BP1联合照射组裸鼠的肿瘤生长速度最慢（p<0.05）,MDC1和53BP1转染加放疗组的相对生长速率较阴性对照组和空白组降低,,生长抑制率增加（p<0.05）。MDC1转染联合照射组的q值为1.36, 53BP1转染联合照射组的q值为1.45,两组的q值均大于1;③MDC1和53BP1转染加照射组裸鼠体内ECA109细胞的CHK1和CHK2的蛋白表达产物没有明显变化,其相对光密度比值与对照组和单纯照射组比较没有统计学差异（P>0.05）,但是瘤组织中CHK2T68的磷酸化水平明显降低（P<0.05）,各组裸鼠的瘤组织中细胞周期分布和凋亡细胞的比例没有明显差异。结论:采用RNA干扰技术降低基因MDC1和53BP1的蛋白表达后可有效地抑制照射后裸鼠移植瘤的生长。以RNA干扰降低基因MDC1和53BP1的蛋白表达为基础的基因治疗和放射治疗联合使用,对增加裸鼠移植瘤放射治疗效果有一定作用,但如何达到最大增敏效果,还需要我们进行更深一步的探索。