Wnt/β-catenin信号通路在乳腺癌多药耐药中的作用及机制研究

论文摘要

背景与目的：乳腺癌是一个世界范围内的严重危害妇女健康的恶性肿瘤之一。化疗在乳腺癌的治疗中有着重要的作用。然而,肿瘤多药耐药（multidrug resistance, MDR）一直是乳腺癌化疗效果难以突破的一个瓶颈,目前尚无有效的治疗策略。因此,研究乳腺癌的耐药机制,寻找新的治疗靶点是目前研究重点。乳腺癌的化疗耐受机制十分复杂,虽然各类文献陆续有些报道,但至今仍无定论。本课题拟在实验室前期已建立的5-氟尿嘧啶（5-FU）诱导的乳腺癌多药耐药细胞系的基础上,应用基因芯片技术高通量地筛选人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/5-FU与亲本细胞株MCF-7之间的差异基因表达谱。通过筛选鉴定耐药相关基因及其基因功能分析,探讨MDR相关基因信号调控网络,试图寻找MDR新的标志物,为进一步阐述乳腺癌MDR机制,开展逆转耐药的靶向治疗,提高乳腺癌化疗效果提供新的理论依据。方法：（1）选择5-FU诱导的人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/5-FU及其亲本细胞株MCF-7为研究对象,应用含21522个基因的人寡核苷酸芯片检测5-FU耐药细胞株MCF-7/5-FU与亲本细胞株MCF-7基因表达谱,筛选耐药相关基因。并且,通过实时定量PCR（Real-time quantitative PCR, qRT-PCR）对部分差异基因mRNA表达水平进行验证。通过WesternBlot检测β-catenin蛋白在胞浆、核中分布情况。（2）构建人GSK3B基因的慢病毒重组表达载体,通过293T细胞包装,经过浓缩纯化获得高滴度病毒颗粒后,体外病毒感染耐药细胞MCF-7/5-FU,建立GSK-3β高表达细胞系。通过Western Blot、qRT-PCR、MTS检测GSK-3β过表达细胞系相应基因表达以及药物敏感性的影响情况；构建靶向人CTNNB1基因（β-catenin）的RNAi慢病毒重组表达载体,经过包装、浓缩纯化获得高滴度病毒颗粒后,体外病毒感染耐药细胞MCF-7/5-FU,建立β-catenin低表达细胞系。通过Western Blot、qRT-PCR、MTS检测β-catenin（?）表达细胞系相应基因表达以及药物敏感性的影响情况。（3）通过Western Blot检测不同细胞系不同处理组细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关因子蛋白质水平的表达情况；通过实时定量PCR检测不同细胞系不同处理组细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关因子mRNA水平的表达情况；流式细胞术分析不同细胞系不同处理组细胞周期和凋亡的变化情况；通过免疫荧光实验观察β-catenin（?）（?）NF-кB蛋白核移位情况；通过报告基因共转染试验检测（?）GSK3B基因对BCRP启动子的活性调节；并通过EMSA、ChIP实验进一步分析NF-кB对BCRP启动子区域的直接结合情况。结果：（1）通过基因芯片技术检测5-FU诱导的乳腺癌耐药细胞株MCF-7/5-FU与亲本细胞株MCF-7基因表达谱,得到了两组乳腺癌细胞株差异表达的基因,并初步筛选出在两个细胞株中明显差异表达的基因共有635个,其中217个基因在5-FU耐药细胞株中上调,418个基因下调。上调基因主要有Bcl-2、BIRC5 （Survivin）、ABCG2 （BCRP）、LEF1等,下调的基因主要是GSK3B（GSK-3β）、CDH1 （E-cadherin）等。功能涉及不同的分子功能分类,参与多个生物学过程,主要涉及到细胞调亡、细胞骨架及信号传导、细胞增殖、分化及周期调控、膜运输蛋白、DNA修复、基因转录与翻译、细胞粘附以及细胞侵袭与转移等方面。（2）运用实时定量PCR技术对部分差异表达在2倍以上的GSK3B、CDH1、LEF1、ABCG2等基因进行mRNA水平的验证,结果显示实时定量PCR结果与芯片结果具有良好的一致性,进一步证实了芯片结果的可靠性,对筛选策略的有效性提供了一定的实验支持。（3） Western Blot结果显示MCF-7/5-FU细胞中β-catenin,总蛋白表达水平与MCF-7细胞相比无明显改变；但是MCF-7/5-FU细胞核内β-catenin与MCF-7细胞相比明显增加。经LiCl处理后的MCF-7/5-FU细胞核内P-catenin蛋白增加更加明显。（4）成功构建了GSK3B基因过表达和CTNNB1基因干扰慢病毒重组载体,包装纯化后的病毒颗粒分别感染MCF-7/5-FU细胞后经过Puromycin和G418抗性筛选培养获得GSK-3β高表达系MCF-7/5-FU/GSK（?）β-catenin氐表达系MCF-7/5-FU/siCAT。（5） GSK-3β过表达包装病毒和β-catenin干扰包装病毒分别感染MCF-7/5-FU能部分逆转MCF-7/5-FU细胞多药耐药性。MCF-7/5-FU/GSK组与对照组相比对5-FU、THP、Mit和Taxol药物敏感性分别提高了4.06、2.12、3.01和2.00倍。MCF-7/5-FU/siCAT组与对照组相比对5-FU、THP、Mit（?）Taxol药物敏感性分别提高了3.80、2.52、2.62和2.06倍。两者差异具有统计学意义（p<0.05）。（6）流式分析结果显示MCF-7/5-FU细胞与亲本细胞MCF-7细胞相比G0/G1期细胞数增加,S期变化无差异,凋亡率减少。GSK-3β过表达和β-catenin基因干扰慢病毒感染组与未感染组相比G0/G1期细胞数下降,S期变化不明显,凋亡率明显增加；LiCl预处理组与未处理组相比G0/G1期细胞数增加,凋亡率下降。（7） Western Blot结果显示MCF-7/5-FU细胞中Survivin、Bcl-2和BCRP的蛋白表达水平明显高于MCF-7细胞组；NF-кB总蛋白表达水平无明显改变；但是MCF-7/5-FU细胞核内NF-кB蛋白与MCF-7组相比明显增加,LiCl预处理组NF-кB蛋白核内表达增加更加明显。GSK-3β过表达和β-catenin基因干扰病毒感染组与未感染组相（?）BCRP的蛋白表达水平显著下降。LiCI预处理组细胞与未处理组相（?）BCRP蛋白表达水平增加明显,NF-кB活性抑制剂MG132处理后BCRP蛋白表达下降。Real-time PCR检测结果与Western Blot结果基本一致。（8）应用免疫荧光技术检测β-catenin（?）NF-κB蛋白,MCF-7/5-FU组与MCF-7组相比出现蛋白核移位现象。LiCl处理组蛋白核移位更加明显。（9）GSK-3p过表达质粒与BCRP启动子报告质粒共转染MCF-7/5-FU细胞可明显降低BCRP启动子活性；当加入NF-κB活性抑制剂MG132处理后BCRP启动子活性降低程度更加明显；而加入LiCl抑制剂处理后BCRP启动子活性增强。凝胶迁移电泳分析（EMSA）结果显示NF-κB可以与位于BCRP启动子上的NF-κB（p50）结合位点结合。染色质免疫沉淀实验（ChIP）进一步证实了转录因子NF-κB（p50）可以直接结合于BCRP基因启动子区的NF-κB（p50）结合位点上。上述实验结果说明GSK-3β可调节BCRP基因的表达,可能通过NF-κB（p50）活性抑制来实现对BCRP基因的负向调控作用。结论：（1）获得乳腺癌多药耐药基因表达谱,差异基因涉及到细胞调亡、细胞骨架及信号传导、细胞增殖、分化及周期调控、膜运输蛋白、DNA修复、基因转录和翻译、细胞粘附以及细胞侵袭与转移等多种遗传学改变。（2）分别建立了慢病毒感染的GSK-3β高表达以及β-catenin低表达的乳腺癌细胞亚系MCF-7/5-FU/GSK和MCF-7/5-FU/siCAT,为乳腺癌耐药机制的研究提供了很好的细胞模型。（3） Wnt/β-catenin信号通路的激活在乳腺癌细胞多药耐药中起着非常重要的作用。其主要是通过调节NF-кB活性：一方面影响细胞周期和凋亡,另一方面通过调节一些膜蛋白的表达。这可能是Wnt/β-catenin信号通路介导5-FU诱导的乳腺癌耐药细胞株MCF-7/5-FU产生多药耐药的重要机制之一。（4）细胞内的转录因子NF-кB在Wnt/β-catenin通路调节细胞生长和耐药性过程中发挥着重要作用。为确立和完善细胞多药耐药的产生机制并为进一步的基因分析和基因治疗提供新的思路。（5） Wnt/β-catenin信号通路及其介导的相关信号网络,为全面阐明肿瘤化疗耐药的机制提供重要线索,提示Wnt/β-catenin通路中某些相关基因如GSK-3β、β-catenin等有望成为临床预测包含5-FU化疗方案化疗效果的标志物及其干预可作为临床逆转肿瘤多药耐药的重要手段之一。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 中英文名词及缩写对照
• 前言
• 第一部分 应用基因芯片技术筛选乳腺癌多药耐药相关基因
• 引言
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第二部分 Wnt/β-catenin信号通路在5-FU诱导的乳腺癌多药耐药中的作用
• 引言
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第三部分 Wnt/β-catenin信号通路介导的5-FU诱导的乳腺癌多药耐药机制研究
• 引言
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间主要研究成果