高温胁迫下水稻热激蛋白的作用机理研究

论文摘要

CO2的大量排放导致大气温度升高,全球气候变暖,夏季极端高温和持续高温的频繁出现,对水稻的安全生产构成极大的威胁。但水稻的不可移动性限制了其逃避外界环境胁迫的能力,水稻只能通过内在的防御机制来抵御高温胁迫。其中,热激蛋白（Heat shock protein, HSP）在水稻（Oryza sativa L.）应对高温胁迫中起了重要的作用。本项目研究以3个具有不同耐高温胁迫能力的水稻品种（Oryza sativa L.）:日本晴Nipponbare （耐高温胁迫）、Azucena （Azu,高温敏感型）和Co39 （耐高温胁迫型）为材料,分析高温胁迫下水稻热激蛋白质的表达及其互作蛋白质,探讨热激蛋白在水稻应对高温胁迫过程中的作用机制。1、应用2-DE和RT-PCR技术,分析高温胁迫下热激蛋白的表达。发现高温胁迫下不同水稻品种叶片中的热激蛋白HSP26.7, HSP23.2, HSP17.9A, HSP17.4和HSP16.9A的表达量均上调。耐高温水稻的sHSP表达量高于敏感型水稻sHSP的表达量。而且随着高温胁迫时间的延长,耐高温水稻的sHSP表达量未出现明显的下降趋势。同时高温胁迫下日本晴根系、开花期日本晴叶片的sHSP也都呈上调表达。进一步sHSP的RT-PCR结果验证了蛋白质的表达。表明sHSP的上调表达是水稻应对高温胁迫的一种防御机制。同时sHSP蛋白质表达水平也可以作为评价不同水稻品种耐高温胁迫能力的一个指标。2、应用2-D Native/SDS-PAGE技术分离高温胁迫下水稻叶片的蛋白质复合体,筛选到4对含HSP的复合体,分别命名为C1,C2,C3和C4。高温胁迫下HSP18.1、HSP17.9A、HSP17.7和HSP16.9A 4个小热激蛋白组成蛋白质复合体C1,酵母双杂交的试验结果进一步验证了小热激蛋白间的互作。热激蛋白101与苹果酸脱氢酶、硫胺素合成蛋白处于同一个蛋白质复合体C2内。OSJNBa0027H06.1是一类热激蛋白,与甲基丙二酸半醛脱氢酶及GS组成蛋白质复合体C3,同样提高了GS的酶活性。热激蛋白81-1与2个葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶家族成员和果糖二磷酸醛缩酶互作,影响水稻体内能量的糖代谢。在His-Pull down实验,发现了10个可能与HSP16.9A互作的蛋白,这10个蛋白主要负责糖酵解过程和ATP的合成,暗示着该蛋白质复合体参与胞内的能量代谢过程。所有这些为从热激蛋白质的作用途径揭示水稻应对高温胁迫的分子防御机制奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 国内外研究现状
• 1.1.1 植物HSP 家族的研究概况
• 1.1.2 水稻HSP 的研究进展
• 1.2 蛋白质互作技术研究进展
• 1.2.1 免疫共沉淀
• 1.2.2 蛋白质亲和层析
• 1.2.3 沉降分析
• 1.2.4 Far-Westerm blotting
• 1.2.5 酵母双杂交系统
• 1.2.6 蛋白质芯片
• 1.2.7 绿色荧光蛋白邻近成像法
• 1.2.8 Blue Native-PAGE 和Native-PAGE
• 1.3 本课题的研究思路
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验设计
• 2.3 蛋白质组学研究方法
• 2.3.1 差异蛋白质：利用常规的双向电泳的方法进行（2-DE）
• 2.3.2 蛋白质的互作：利用非变性双向电泳技术（2-D Native/SDS-PAGE,（N-PAGE））
• 2.3.3 蛋白质表达图谱的建立及差异点的确定
• 2.3.3.1 差异蛋白质表达图谱的建立及差异点的确定
• 2.3.3.2 互作蛋白质表达图谱的建立及互作变化蛋白点的确定
• 2.3.4 蛋白质点胶内酶解及肽段提取
• 2.3.5 MALDI-TOF/MS，MALDI-TOF/TOF/MS 和 LC MS/MS
• 2.4 RT-PCR
• 2.5 酵母双杂验证蛋白互作
• 2.6 原核表达 HSP16.9A 及其His-Pull down
• 2.7 Western Blotting
• 2.8 水稻叶片谷氨酰胺合成酶（GS）活性测定
• 3 结果
• 3.1 高温胁迫下，不同水稻品种苗期叶片的差异表达蛋白质
• 3.2 高温胁迫下，不同水稻品种sHSP 的上调表达
• 3.3 高温胁迫下，日本晴开花期sHSP 的表达分析
• 3.4 高温胁迫下，日本晴根系sHSP 的上调表达
• 3.5 高温胁迫下，水稻叶片的蛋白互作变化
• 3.5.1 高温胁迫下，叶片蛋白互作变化图谱构建
• 3.5.2 高温胁迫下，叶片蛋白质互作变化结果
• 3.6 酵母双杂结果
• 3.7 氨酰胺合成酶（GS）活性测定
• 3.8 His-Pull-down
• 4 讨论
• 4.1 高温胁迫下不同水稻品种的蛋白质差异表达
• 4.2 高温胁迫下不同水稻品种若干sHSP 的差异表达
• 4.3 高温胁迫下水稻体内sHSP 间的互作
• 4.4 高温胁迫下热激蛋白与其他蛋白质间的互作
• 5 小结
• 参考文献
• 附录一 本研究所使用的酵母双杂交载体及表达载体
• 附录二 高温处理下不同水稻品种叶片差异蛋白的质谱分析结果
• 附录三 高温处理下日本晴根系差异蛋白的质谱分析结果
• 附录四 攻硕期间发表的论文
• 致谢