随机扩增多态性DNA技术鉴定单核细胞增生李斯特菌的研究

论文摘要

食源性致病菌是引起各类食物安全事件的重要诱因之一,世界各国由于食源性致病菌污染饮食,而爆发的食品安全事件时有发生,特别是近些年来由单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）引起的食物中毒事件急剧增长,已在日常生活中随处可见,特别是在肉制品和奶制品中,因单增李斯特菌污染食物而致人患病的事件已严重影响人类的正常生活。该菌之所以在现代生活中能广泛存在我们的饮食中,一方面由于该菌耐低温,且在低温条件下生长良好；另一方面因为现代人越来越多饮食速食食品和冷藏食品,这些习惯为单增李斯特菌的生长和传播提供良好的条件,因此,目前急需建立一种快捷、高效、操作简便的检测辨别技术确定单增李斯特菌,为我们的饮食安全树立一道安全屏障。RAPD检测技术起源于20世纪90年代,其方法由于利用随机引物对样品DNA进行扩增,事先不需要知道被测样品的基因序列,且扩增的多态性条带可用于样品间亲缘关系的分析,故被研究学者广泛应用于各个领域,从而形成一项比较成熟的技术。本论文旨在通过对自主设计的10条随机引物进行RAPD-PCR扩增,依据扩增图谱带型多样性、清晰度和重复性等方面的分析,筛选出对李斯特菌属属内菌株有特异性的引物,以及对单增李斯特菌分离株有特异性的引物,从分子分型方向对单增李斯特菌分离株进行同源性分析,鉴别出各分离株与单增李斯特菌标准株CMCC54004间的亲缘相互关系,并依据特异性引物扩增获得特异性条带以区别除单增李斯特菌之外的属外其它菌株,以期建立快速检测农副产品中单增李斯特菌的目的。通过试验,获得一下结论：（1）采用四种DNA提取方法提取单增李斯特菌样品DNA,通过对DNA提取方法的优化,筛选出可获得高质量、高重复性模板DNA的提取方法——基因组DNA试剂盒提取法；（2）通过对RAPD-PCR反应体系中DNA浓度、聚合酶浓度、引物浓度、dNTP Mixture浓度和Mg2+浓度5个实验因子进行单因素实验和正交实验分析,确定最优的反应体系为：总体积为20μL,其中各成分浓度为200μM dNTP Mixture、20pmol引物浓度、5 mM Mg2+浓度、2 U Taq DNA聚合酶浓度、50 ng模板DNA浓度；（3）依据筛选出的最优反应程序,对10条随机引物特异性筛选,确定通过引物AM 09 （5’-TGGTGACCGT-3’）可特异性区分单增李斯特菌各分离株,利用组合引物AM 07+AM 09可特异性区分李斯特菌属内6种标准株,且利用引物AM 09扩增单增李斯特菌CMCC 54004获得473 bp特异性带型,可区分除单增李斯特菌之外的菌株,因此这条特异性带型结合引物AM 09可用于食物中单增李斯特菌污染情况的调查研究,对单增李斯特菌分离株的分型研究也很有用处；（4）依据能否扩增473 bp特异性条带,通过人工模拟污染实验以及对纯菌液RAPD检测技术检出限的确定,结果表明牛奶和牛肉增菌3 h后可检测出特异性带型,检出限分别为1.79×105 cfu/mL和2.48×105 cfu/mL,黄瓜中的检出限为1.98 X 105cfu/mL,需增菌6 h。因此从模拟实验中证实本试验设计的方案可用于实际应用中的样品检测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 单增李斯特菌的生物学特性
• 1.1.1 单增李斯特菌的形态及培养特性
• 1.1.2 单增李斯特菌的生化特性
• 1.1.3 单增李斯特菌的致病性及相关毒力因子
• 1.2 单核细胞增生李斯特菌流行病学研究进展
• 1.2.1 分布
• 1.2.2 传播途径
• 1.2.3 易感人群和动物及临床表现
• 1.2.4 流行情况
• 1.3 单核细胞增生李斯特菌的检测方法研究现状
• 1.3.1 传统微生物鉴定检测法
• 1.3.2 免疫学检测方法
• 1.3.3 分子生物学检测法
• 1.3.4 化学检测方法
• 1.4 随机扩增多态性DNA技术分析（RAPD）
• 1.4.1 随机扩增多态性DNA技术的基本工作原理
• 1.4.2 随机扩增多态性DNA技术的特点
• 1.4.3 随机扩增多态性DNA技术的应用
• 1.5 本研究目的和意义
• 2 单增李斯特菌模板DNA样品提取方法的筛选
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要培养基
• 2.1.3 主要试剂配制以及试剂来源
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 单增李斯特菌的培养与DNA提取
• 2.3 实验结果与分析
• 2.3.1 单增李斯特菌模板DNA样品提取方法的筛选
• 2.3.2 单增李斯特菌模板DNA样品的制备
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 3 单增李斯特菌RAPD反应体系条件优化与重复性实验
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 主要培养基
• 3.1.5 随机引物
• 3.1.6 单增李斯特菌模板DNA样品准备
• 3.2 方法
• 3.2.1 RAPD-PCR预扩增实验
• 3.2.2 RAPD-PCR最优扩增条件的确定
• 3.2.3 RAPD-PCR重复性实验验证
• 3.3 实验结果与分析
• 3.3.1 特异性引物预筛选
• 3.3.2 RAPD-PCR扩增条件优化
• 3.3.3 RAPD-PCR重复性实验验证
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 4 单增李斯特菌RAPD-PCR分析方法分型研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 主要培养基
• 4.2 方法
• 4.2.1 菌体的培养与DNA提取
• 4.2.2 RAPD-PCR分型技术研究
• 4.3 实验结果与分析
• 4.3.1 李斯特菌属内标准菌株特异性引物的筛选
• 4.3.2 李斯特菌属外标准菌株特异性引物的筛选
• 4.3.3 聚类分析
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 5 单增李斯特菌RAPD分型技术在农副产品中的应用
• 5.1 材料
• 5.1.1 农产品样品
• 5.1.2 检测菌株
• 5.1.3 随机引物
• 5.1.4 主要仪器
• 5.1.5 主要试剂
• 5.2 方法
• 5.2.1 适宜浓度菌悬液的制备
• 5.2.2 模板样品DNA的提取
• 5.2.3 RAPD-PCR检出限的测定
• 5.2.4 空白农产品样品的制备
• 5.2.5 人工模拟污染样品的制备
• 5.2.6 人工污染样品检出限的确定
• 5.2.7 RAPD-PCR技术对食物中存在的单增李斯特菌调查研究
• 5.3 实验结果与分析
• 5.3.1 菌液过夜培养后菌体浓度的确定
• 5.3.2 RAPD-PCR检出限的确定
• 5.3.3 人工模拟污染试验检出限确定
• 5.3.4 食物中单增李斯特菌污染现状的调查研究
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 6 结论
• 6.1 研究总结
• 6.2 创新点
• 6.3 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢