改性聚N-异丙基丙烯酰胺协助蛋白质体外复性研究

论文摘要

蛋白质体外重折叠复性技术已成为目前基因工程蛋白质产业化的瓶颈问题。开发新型、高效,同时又易于操作和回收的蛋白质体外复性添加剂成为近年来的研究热点之一,其中聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAM）作为一种温敏型聚合物受到了研究者的极大关注。本文以温敏型PNIPAM类聚合物作为研究对象,采用共聚、表面接枝以及特定功能基团引入等方法对聚合物进行了改性,并对改性后PNIPAM聚合物协助蛋白质体外复性过程进行了研究。采用反相悬浮法合成一系列具有不同丙烯酸钠含量的粒状共聚凝胶P（NIPAM-co-SA）,对凝胶粒子的形态以及温敏性能进行了研究。将共聚凝胶用于亲水性较强的溶菌酶体外复性,考察了各种复性条件对于溶菌酶复性过程的影响。当蛋白浓度为250μg/ml时,P（NIPAM-co-SA） （A=4%）的加入可以使复性收率从稀释复性的55.6%增加到76.5%。共聚凝胶重复利用5次后溶菌酶的活力回收率仍有61.5%。通过对复性蛋白的结构进行分析,确定共聚凝胶通过有效抑制复性过程中聚集体的生成提高复性收率。采用无皂乳液聚合法和光引发法合成了接枝有PNIPAM毛发的聚苯乙烯微球（PS-grafted-PNIPAM）,研究了微球的形态和温敏性能。考察了具有不同核心大小和毛发长度的PS-grafted-PNIPAM微球协助模型蛋白溶菌酶和重组人γ-干扰素（rhIFN-γ）包涵体体外复性的效果,优化了加胶量、温度、尿素浓度等复性条件。实验结果表明,PS-grafted-PNIPAM微球可以大幅提高溶菌酶和rhIFN-γ的复性收率。采用RAFT方法合成了三种具有不同巯基负载量的PS-grafted-PNIPAM微球。以溶菌酶为模型蛋白考察了巯基改性PS-grafted-PNIPAM微球在不同氧化型谷胱甘肽（GSSG）浓度下协助复性的效果,为后续研究提供基础数据。改性PNIPAM微球通过与变性蛋白的疏水相互作用协助目标蛋白质进行体外重折叠复性,具有良好的协助蛋白质体外复性效果,同时PNIPAM的温敏性有助于蛋白质复性后与微球分离,可将微球回收重复利用,是一种新型高效的复性添加剂,具有广阔的应用前景。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 蛋白质体外复性的研究
• 1.2.1 包涵体的形成
• 1.2.2 包涵体的分离、纯化和溶解
• 1.2.3 蛋白质的复性机制
• 1.2.4 二硫键的形成
• 1.2.5 蛋白质体外复性常用方法
• 1.3 NIPAM类温敏型聚合物及其在协助蛋白质体外复性中的应用
• 1.3.1 NIPAM类温敏型聚合物的性质
• 1.3.2 NIPAM类温敏型聚合物的制备
• 1.3.3 温敏型聚合物在协助蛋白质体外复性中的应用
• 1.3.4 温敏型聚合物协助蛋白质体外复性的机理
• 1.4 NIPAM类温敏型聚合物的功能改进
• 1.4.1 NIPAM类温敏型共聚物
• 1.4.2 线性PNIPAM接枝聚合物
• 1.4.3 接枝PNIPAM中巯基的引入
• 1.5 本文研究思路及内容
• 1.5.1 溶菌酶
• 1.5.2 重组人γ-干扰素
• 1.5.3 研究思路
• 第二章 P（NIPAM-co-SA）共聚凝胶协助溶菌酶体外复性研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与仪器
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 粒状PNIPAM及其共聚凝胶的制备
• 2.3.2 粒状PNIPAM及其共聚凝胶的表征
• 2.3.3 溶菌酶的变复性
• 2.3.4 溶菌酶活性测定
• 2.3.5 蛋白质结构分析
• 2.4 实验结果与讨论
• 2.4.1 粒状共聚凝胶P（NIPAM-co-SA）的表征
• 2.4.2 粒状共聚凝胶P（NIPAM-co-SA）协助溶菌酶体外复性
• 2.4.3 共聚凝胶的多批次溶菌酶复性过程
• 2.4.4 共聚凝胶协助溶菌酶复性机理探讨
• 2.5 本章小结
• 第三章 PS-grafted-PNIPAM微球协助溶菌酶体外复性研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与仪器
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 PS-grafted-PNIPAM微球的制备
• 3.3.2 PS-grafted-PNIPAM微球的表征
• 3.3.3 PS微球的粒径及PNIPAM毛发厚度的测定
• 3.3.4 PNIPAM高分子毛发温敏特性研究
• 3.3.5 PS-grafted-PNIPAM微球协助溶菌酶体外复性
• 3.4 实验结果与讨论
• 3.4.1 PS-grafted-PNIPAM微球外观形态及表面特性
• 3.4.2 PNIPAM高分子毛发的温敏性能
• 3.4.3 PS-grafted-PNIPAM微球协助溶菌酶体外复性过程
• 3.4.5 PS-grafted-PNIPAM微球利用次数对溶菌酶复性的影响
• 3.5 本章小结
• 第四章 PS-grafted-PNIPAM微球协助重组人γ-干扰素包涵体复性研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料与仪器
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 重组人γ-干扰素的发酵
• 4.3.2 菌体收集与破碎
• 4.3.3 包涵体的洗涤纯化及溶解变性
• 4.3.4 重组人γ-干扰素的复性
• 4.4 分析方法
• 4.4.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
• 4.4.2 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度
• 4.4.3 重组人γ-干扰素的活性测定
• 4.4.4 重组人γ-干扰素复性过程的结构分析
• 4.5 实验结果与讨论
• 4.5.1 PS-grafted-PNIPAM微球的制备及表征
• 4.5.2 重组人γ-干扰素包涵体的发酵和纯化
• 4.5.3 PS-grafted-PNIPAM微球协助重组人γ-干扰素包涵体复性
• 4.6 本章小结
• 第五章 巯基改性PS-grafted-PNIPAM微球协助溶菌酶复性初探
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料与仪器
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 巯基改性PS-grafted-PNIPAM微球的制备
• 5.3.2 DTNB法测自由巯基的含量
• 5.3.3 PS-grafted-PNIPAM微球协助溶菌酶体外复性
• 5.4 实验结果与讨论
• 5.4.1 巯基改性PS-grafted-PNIPAM微球的制备和表征
• 5.4.2 巯基改性PS-grafted-PNIPAM微球协助溶菌酶体外复性
• 5.5 本章小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 作者简介