腺病毒介导重组人源化ING4基因抑制非小细胞肺癌NCI-H460细胞生长机制研究

论文摘要

目的:重组构建人源化ING4腺病毒表达载体,并探究其对非小细胞肺癌NCI-H460细胞株体内外生长抑制作用及其相关分子机制。方法:运用定点突变技术,在已成功克隆mING4（鼠ING4）的基础上,根据hING4（人ING4）氨基酸序列,进行重组构建。设计两对突变引物P1、P2和P3、P4及全长ING4上下游引物P5、P6,通过四轮PCR,将mING4基因序列进行人源化改造,获得了编码hING4氨基酸的基因序列（简称ING4）。将获得酶切目的基因片段,连接到转移载体pAdTrack-CMV上,形成重组转移载体pAdTrack-CMV-ING4。重组转移载体经PmeI酶切后与pAdEasy-1腺病毒载体在BJ5183大肠杆菌中同源重组,得到重组腺病毒载体pAdeasy-1-pAdTrack-CMV-ING4,经PacI酶切后脂质体转染QBI-293A包装细胞,获得重组腺病毒Ad-ING4。通过类似的方法获得了重组空载体病毒Ad-null。将获得同源重组Ad-ING4病毒感染非小细胞肺癌NCI-H460细胞（p53野生型）,运用RT-PCR及荧光显微镜检测ING4基因在H460细胞中表达及对H460细胞毒作用（CPE）;运用MTT法、细胞集落形成试验及流式细胞仪检测Ad-ING4对肿瘤细胞生长抑制及诱导凋亡作用;运用激光共聚焦显微镜及透射扫描电镜检测H460细胞经ING4基因作用后形态学改变;运用RT-PCR、Western-blotting检测分析Ad-ING4诱导肿瘤细胞凋亡可能分子机制;运用RT-PCR和ELISA方法检测ING4基因对肿瘤主要血管生成相关基因VEGF的作用;在nu/nu裸鼠皮下建立NCI-H460肺癌荷瘤鼠模型,观察Ad-ING4基因对肿瘤生长抑制作用及对血管生成影响。结果:基因序列检测和RT-PCR结果证实获得重组人源化ING4基因,并成功构建重组人源化ING4腺病毒表达载体。RT-PCR和荧光显微镜检测证实ING4基因可以在H460细胞中稳定表达并对H460细胞产生细胞毒作用（CPE）;MTT检测和细胞集落形成试验结果表明较对照组（Ad-null组, PBS组）相比,ING4基因可以明显抑制基因治疗组肿瘤细胞生长;流式细胞仪检测证实Ad-ING4可诱导肿瘤细胞凋亡;激光共聚焦显微镜和透射扫描电镜检测显示H460细胞经ING4基因作用后可发生细胞凋亡形态学改变,并出现凋亡小体;RT-PCR、Western-blotting检测结果提示Ad-ING4基因以p53依赖方式诱导肿瘤细胞上调p21和Bax基因表达,下调Bcl-2和Survivin基因表达来诱导肿瘤细胞凋亡;RT-PCR和ELISA检测提示ING4基因可以抑制肿瘤主要血管生成相关基因VEGF表达;体内试验表明Ad-ING4基因可以抑制肿瘤生长并抑制肿瘤体内血管生成。结论:运用定点突变技术对mING4进行了人源化改造,并成功重组构建了人源化ING4腺病毒表达载体;经RT-PCR和荧光显微镜检测证实腺病毒Ad-ING4可以在非小细胞肺癌NCI-H460细胞株中稳定表达;腺病毒Ad-ING4在非小细胞肺癌NCI-H460细胞株中表达可致肺癌细胞产生细胞病变（CPE）,并主要通过诱导细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成来抑制肿瘤细胞增殖;腺病毒Ad-ING4诱导非小细胞肺癌NCI-H460细胞凋亡的主要分子机制是以p53依赖方式上调促凋亡因子Bax表达,下调Bcl-2、Survivin表达,诱导肿瘤细胞凋亡;腺病毒Ad-ING4同时通过促进p53反应基因p21表达,上调Bax表达,并改变Bax/Bcl-2比例,促进肿瘤细胞凋亡;腺病毒Ad-ING4可以抑制肿瘤主要血管生成相关基因VEGF的表达,并在体内抑制肿瘤血管生成;腺病毒Ad-ING4注射可以抑制H460实体瘤肿瘤生长。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 参考文献
• 第一部分 重组人源化ING4 腺病毒载体构建
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二部分 重组腺病毒介导ING4 基因抑制 NCI-H460 细胞体外生长机制研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三部分 重组腺病毒介导ING4基因抑制肺癌体内生长及血管生成基因表达机制研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 结论
• ING 蛋白家族与肿瘤研究进展
• 攻读学位期间发表和待发表的文章
• 缩略词语
• 致谢
• 详细摘要