高通量序列数据生物信息学分析的探索与改进：斑马鱼胚胎发育转录组研究和日本血吸虫Hox基因家族分析

论文摘要

斑马鱼,因其生长速度快、易于培养而成为研究脊椎动物生长发育的理想生物模型。以往,依靠基因芯片技术的转录组研究因受到其自身技术原理的限制,很难进行大规模的转录组学分析。随着深度测序技术的发展,基于深度测序技术的转录组测定方法逐渐兴起。本研究采用SOLiD3测序系统对斑马鱼的9个发育时期共10个样本进行了转录组测序,并通过生物信息学方法,研究斑马鱼转录组在发育过程中变化。我们对斑马鱼9个发育时期中提取的10个RNA文库进行RNA测序,共得到的超过30亿条测序读段（Reads）。同时利用斑马鱼Unigene序列文库,将这些读段都定位到Unigene参考序列文库中,最终大约有34.82%的读段被定位到参考序列上。根据读段在Unigene上的定位情况以及代表基因转录水平的标准化数据RPKM方法,测定了Unigene大约89.2%的序列的表达谱。通过比较相邻时期的相对表达量数据和斑马鱼胚胎发育各个时期之间基因的表达差异,总共有39,824条序列在胚胎发育过程中发生了显著性的上调或下调（p-value<=0.001）。进一步的聚类分析（包括Gene Ontology, Pfam, KEGG Pathway）结果表明,在胚胎发育的初期（如卵裂期,囊胚期）细胞大量的基因的表达处于关闭或者低水平表达状态,只有一些与细胞周期、转录、DNA/蛋白质修饰和基因沉默相关的基因表现出较高的表达水平,而从原肠胚期开始大量的基因开始表达。此外,根据聚类分析的结果展示了斑马鱼胚胎转录组的动态改变情况。例如：胚胎的体节和器官的发育主要从体节期开始发育；从孵化期的60hpf开始斑马鱼胚胎的一些器官和组织就表现出相应功能,特别是神经系统。在第二章,在全基因组水平对日本血吸虫Hox基因家族进行生物信息学分析。Hox基因拥有特殊的同源框结构域,它是一个在动物中广泛存在的古老的调节体节发育的转录因子。因为其保守和胚胎发育过程中的重要作用所以在进化和发育生物学中研究的很多。通过序列相似性和系统进化分析,我们首先发现了日本血吸虫含有8个Hox基因,这8个Hox基因分别属于7个同源系（Hox1, Hox2, Hox3, Hox4, Lox5, Lox4and Post-2）。同时,我们发现日本血吸虫中的Hox2和Hox4基因位于基因组上的相邻位置。此外我们成功的测定了其中4个Hox基因的表达谱。发现Hox基因在日本血吸虫中很有可能没有遵循Hox基因在很多物种中具有的时间线性表达特征。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 绪论
• 1.1 研究目的
• 1.2 概述
• 1.3 测序平台数据输出
• 1.4 测序数据的基本处理
• 1.5 读段定位与表达水平计数
• 1.6 表达差异分析
• 1.7 聚类分析
• 2 斑马鱼胚胎发育转录组生物信息学分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.1.1 斑马鱼材料及测序
• 2.2.1.2 主要仪器设备
• 2.2.1.3 生物信息分析软件数据
• 2.2.2 技术路线和实验方法
• 2.2.2.1 Unigene文库冗余估计
• 2.2.2.2 Unigene文库选择性剪接估计
• 2.2.2.3 Unigene注释
• 2.2.2.4 读段定位
• 2.2.2.5 转录本表达定量和表达差异分析
• 2.2.2.6 表达谱平滑化
• 2.2.2.7 斑马鱼转录组聚类及热图
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 Unigene文库评估
• 2.3.2 读段定位
• 2.3.3 标准化方法比较
• 2.3.4 转录本表达定量及表达差异分析
• 2.3.4.1 参考序列读段数分布统计
• 2.3.4.2 相对表达值计算及显著性分析
• 2.3.4.3 发育时期间的差异
• 2.3.5 与斑马鱼芯片表达谱比较
• 2.3.6 斑马鱼转录组聚类分析
• 2.3.6.1 统计检验结果
• 2.3.6.2 表达趋势聚类
• 2.4 小结
• 3 日本血吸虫Hox基因家族研究
• 3.1 引言
• 3.1.1 Hox基因家族研究概述
• 3.1.2 日本血吸虫概述
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.1.1 日本血吸虫总cDNA
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 主要仪器设备
• 3.2.4 生物信息分析软件
• 3.2.5 技术路线和实验方法
• 3.2.5.1 Hox基因识别
• 3.2.5.2 Hox基因系统进化分析
• 3.2.5.3 引物设计与合成
• 3.2.5.4 Semi-quantitative RT-PCR
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 Hox基因家族成员识别
• 3.3.2 Hox基因表达谱测定
• 3.3.3 Hox基因系统进化分析
• 3.4 小结
• 致谢
• 参考文献