鳗弧菌金属蛋白酶在大肠杆菌中表达、加工与转运及重组蛋白酶的纯化与性质研究

论文摘要

鳗弧菌（Vibrio anguillarum）是一种对水产鱼类危害严重的细菌病原,流行区域广泛,可感染多种鱼类,常给水产养殖业造成巨大的经济损失。鳗弧菌的致病性与许多毒力因子有关,包括胞外蛋白酶、由质粒编码的铁吸收系统、细胞外溶血毒素、细菌鞭毛蛋白等。研究发现胞外蛋白酶是重要的致病因子之一,参与了细菌入侵宿主的毒力机制。鳗弧菌金属蛋白酶全基因ORF编码611个氨基酸的前体前蛋白,包含有四个结构域:信号肽、N-末端的前体肽、成熟区（蛋白酶区）和C-末端延伸区;在随后的分泌过程中切除信号肽和前体肽形成成熟蛋白,分泌到细胞外的成熟蛋白分子量是36kDa,具有活性的蛋白分子量是45 kDa或者47 kDa。为了更好地研究EmpA的表达与加工,本研究将empA基因克隆到阿拉伯糖诱导表达载体pBAD24上,构建重组表达载体pBAD-VAP,在大肠杆菌TOP10中通过加入阿拉伯糖诱导EmpA表达,重组蛋白通过SDS-PAGE和Immunoblotting鉴定分子量为36kDa,与从鳗弧菌细胞培养基上清中纯化的蛋白分子量完全相同,分子量为36kDa的重组蛋白N-端6个氨基酸序列同Milton等报导的成熟EmpA以及前体蛋白全长序列中从200到205氨基酸序列一致,也与根据全长序列推测的44.6kDa蛋白的N-端序列一致,说明重组蛋白的C-端存在大约9 kDa多肽的加工,并发现加热促进蛋白的C-端9kDa多肽的加工,使44.6kDa的蛋白加工成36kDa的成熟蛋白。将重组表达载体pBAD-VAP转入大肠杆菌MC4100A（wt）、CU164A（SecY缺陷型）和B1LKOA（tat缺陷型）中,通过诱导表达EmpA,研究蛋白的转运与加工过程。研究发现,EmpA在大肠杆菌中通过sec途径转运,转运到细胞周质中,在细胞周质中的活性蛋白是相同的分子量（44.6 kDa）构象不同的两种蛋白。有趣的是,在细胞的原生质中,聚集的蛋白前体能够转变成有活性的蛋白酶。当样品加热时,44.6 kDa的EmpA C-端进一步加工,这种加工过程不同于鳗弧菌相同的蛋白和一些同源的锌-蛋白酶。研究发现,蛋白的加工

论文目录

• 摘 要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1. 序言
• 2. 鳗弧菌的特性
• 3. 弧菌胞外金属蛋白酶的研究现状
• 3.1 弧菌胞外金属蛋白酶为重要的致病因子
• 3.2 弧菌胞外蛋白酶在大肠杆菌内表达和加工过程的研究
• 3.3 鳗弧菌金属蛋白酶氨基酸结构分析及同源性比较
• 4. 蛋白质的转位
• 4.1 细菌的细胞膜
• 4.2 蛋白质的转位
• 5. 重组蛋白在大肠杆菌中的分泌
• 5.1 重组蛋白的分泌
• 5.2 结论
• 6. 本论文的研究目的与意义
• 参考文献
• 第二章 鳗弧菌金属蛋白酶在大肠杆菌中的表达及其酶活性研究
• 1. 前言
• 2. 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3. 结果分析
• 3.1 pBAD-VAP 表达载体的鉴定与序列分析
• 3.2 重组蛋白（rEmpA）的表达
• 3.3 重组蛋白rEmpA 酶活测定
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 参考文献
• 第三章 鳗弧菌金属蛋白酶在大肠杆菌中加工与转运的研究..
• 1. 前言
• 2. 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3. 结果分析
• 3.1 TOP10/pBAD24 或TOP10/pBAD-VAP 诱导后的生长曲线
• 3.2 EmpA 加工表达的SDS-PAGE 与Immunoblotting 检测
• 3.3 EmpA 在Wt、Sec 缺陷型与△Tat 缺陷型菌株中的表达
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 参考文献
• 第四章 EmpA 在大肠杆菌中的表达、纯化及重组酶性质研究.
• 1. 前言
• 2. 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3. 结果分析
• 3.1 重组质粒PCR、酶切鉴定，序列鉴定及分析
• 3.2 重组蛋白酶rEmpA-his 的分离与纯化
• 3.3 重组金属蛋白酶rEmpA-his 的酶学性质
• 3.4 纯化的重组酶对不同蛋白底物的降解作用
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 参考文献
• 总结与创新点
• 附录
• 博士期间发表的论文
• 致谢