体外扩增过程中造血细胞生理状态和遗传稳定性研究

论文摘要

体外扩增技术是解决新鲜脐血中造血干/祖细胞数量稀少问题的有效策略,而扩增后细胞的质量和安全性是影响其临床应用的重要因素。本文以脐血CD34+细胞为对象,分别采用有或无血清培养体系,对体外培养细胞的生理状态、遗传稳定性、染色体核型和克隆形成能力进行了系统的分析,获得下列结果：（1）无论细胞培养基有无血清,细胞的比生长速率、S/G2/M期细胞比例、以及细胞内端粒酶活性均有相似的变化趋势,存在一定的相关性；（2）与CD34-细胞相比,在培养过程中CD34+细胞的凋亡率始终维持在较低水平上,低于新鲜分离的CD34+细胞中的凋亡率,表明CD34+细胞具有很强的抗凋亡特性；（3）在细胞培养过程中,与遗传稳定性相关基因Bmil、hTERT和Survivin mRNA的表达水平随培养时间延长均有不同程度的上调,但与K562细胞中的稳定高表达不同,提示细胞培养没有产生细胞恶化的信号;（4）6个脐血样本用含血清培养体系扩增,染色体核型异常比例较高,达2/3。但是这些异常的发生不具有定向性和稳定遗传性,且未表现出异常增殖的特征,提示有血清培养体系扩增的脐血造血干/祖细胞可能有临床安全性风险,但没有足够证据显示培养细胞出现了恶性转化。这些研究对确保培养细胞移植的安全性与有效性具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 脐血造血干/祖细胞
• 1.2 脐血造血干/祖细胞体外扩增
• 1.3 体外扩增与细胞生理状态
• 1.3.1 细胞周期分布
• 1.3.2 细胞凋亡
• 1.3.3 端粒酶活性
• 1.4 扩增后细胞的遗传稳定性
• 1.4.1 细胞恶性转化
• 1.4.2 基因表达失调与细胞恶性转化
• 1.4.3 染色体变异与细胞恶性转化
• 1.5 本课题的意义和研究内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验仪器与设备
• 2.2 实验材料与试剂
• 2.2.1 脐血与脐血细胞分离
• 2.2.2 培养基与血清
• 2.2.3 细胞因子
• 2.2.4 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）试剂
• 2.2.5 细胞周期检测试剂盒
• 2.2.6 凋亡检测试剂盒
• 2.2.7 端粒酶活性检测试剂盒
• 2.2.8 染色体制备试剂
• 2.2.9 其他试剂
• 2.3 实验方法
• +）的分离'>2.3.1 脐血造血干/祖细胞（CB CD34⁺）的分离
• 2.3.2 细胞计数和活率检测
• 2.3.3 脐血造血干/祖细胞体外培养
• 2.3.4 集落形成细胞分析
• 2.3.5 细胞表型分析
• 2.3.6 端粒酶活性检测
• 2.3.7 细胞周期分析
• 2.3.8 细胞凋亡分析
• 2.3.9 染色体核型分析
• 2.3.10 细胞中Bmil、hTERT和Survivin mRNA表达水平的检测
• +细胞中Bmil、hTERT和Survivin mRNA表达水平的检测'>2.3.11 CD34⁺细胞中Bmil、hTERT和Survivin mRNA表达水平的检测
• 2.3.12 软琼脂克隆实验
• 2.3.13 统计学分析
• 第3章 体外扩增过程中细胞生理状态的变化
• 3.1 有血清培养体系中造血干/祖细胞扩增特性以及细胞生理状态的研究
• 3.1.1 造血干/祖细胞体外扩增与生长动力学研究
• 3.1.2 细胞周期分析
• 3.1.3 细胞内端粒酶活性的变化
• 3.1.4 细胞凋亡率的变化
• 3.1.5 本节小结
• 3.2 无血清培养体系中造血干/祖细胞扩增特性以及细胞生理状态的研究
• 3.2.1 造血干/祖细胞体外扩增与生长动力学研究
• 3.2.2 细胞周期分析
• 3.2.3 细胞内端粒酶活性的变化
• 3.2.4 细胞凋亡率的变化
• 3.2.5 本节小结
• 3.3 讨论
• 3.4 本章小结
• 第4章 体外扩增脐血造血干/祖细胞的遗传稳定性研究
• 4.1 有血清培养过程中细胞的遗传稳定性研究
• 4.1.1 扩增后细胞中Bmil、hTERT和Survivin mRNA的表达
• +细胞Bmil、hTERT和Survivin mRNA的表达'>4.1.2 扩增后CD34⁺细胞Bmil、hTERT和Survivin mRNA的表达
• 4.1.3 扩增后细胞的染色体核型分析
• 4.1.4 染色体核型异常与体外增殖的关系
• 4.1.5 体外恶性转化实验
• 4.1.6 本节小结
• 4.2 无血清培养过程中细胞的遗传稳定性研究
• 4.2.1 扩增后细胞中Bmil、hTERT和Survivin mRNA的表达
• +细胞中Bmil、hTERT和Survivin mRNA的表达'>4.2.2 扩增后CD34⁺细胞中Bmil、hTERT和Survivin mRNA的表达
• 4.2.3 本节小结
• 4.3 讨论
• 4.4 本章小结
• 第5章 结论与展望
• 5.1 全文总结
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢