生物法不对称还原生物法不对称还原（R）-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的研究

论文摘要

6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯是降胆固醇特效药他汀类药物的重要手性中间体,具有重要的应用价值。由于酶法不对称催化具有反应条件温和、转化率高及立体选择性好等优点,已经成了诸多手性合成方法的首选。本文在对羰基还原酶表达菌株E.coli BL21（DE3）-pET28a-cr3及葡萄糖脱氢酶表达菌株E.coli BL21（DE3）-pET28a-gdh4发酵条件优化的基础上,构建了双酶耦联体系以解决辅酶再生问题,并对上述重组菌耦联催化（R）-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯还原反应的特性进行了研究。研究工作的主要内容包括:对羰基还原酶表达菌株E.coli BL21（DE3）-pET28a-cr3及葡萄糖脱氢酶表达菌株E.coli BL21（DE3）-pET28a-gdh4发酵条件进行了优化,确定最适的发酵条件,E.coliBL21（DE3）-pET28a-cr3为:种龄7 h,接种量3.0%,37 ℃发酵培养时间2 h,诱导剂乳糖终浓度9.0 g·L-1,28 ℃诱导9 h。在此条件下羰基还原酶比酶活达到2622.3 U·g-1,其生物量（DCW）为 3.6 g·L-1。E.coli BL21（DE3）-pET28a-gdh4 的最优培养条件为:种龄7 h,接种量4.0%,37 ℃发酵培养时间2 h,诱导剂乳糖终浓度9.0 g·L-1,28 ℃诱导9 h。为3410.4 U·g-1,其生物量（DCW）为3.5 g·L-1。选择羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶双酶耦联催化（R）-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原制备他汀药物关键手性合成子6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯。生物催化条件优化结果揭示,在不添加外源性辅酶NADP（H）、菌体用量15.0gDCW·L-1、147.0g·L-1（R）-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、128.2g·L-1葡萄糖,30.0℃、pH6.5条件下反应6.0 h后,底物转化率100.0%,产物d.e.值≥99.5%。采用冷冻干燥技术可以对菌体进行较长时间的保存,同时冻干细胞在进行催化时不再需要细胞破碎,也不需要外加辅酶（NADP+）。催化条件为:温度30.0 ℃,pH恒定为6.5,缓冲液K2HP04-KH2P04（100.0 mmol·L-1）,（R）-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯浓度147.0 g·L-1,辅助底物葡萄糖浓度 128.2 g·L-1,E.coli BL21（DE3）-pET28a-cr3 与E.coliBL21（DE3）-pET28a-gdh4质量比为2:1,菌体总浓度（干重,冻干细胞保存3周）15.0 g·L-1。在该条件下,反应7～8 h后结束,转化率 100.0%,d.e.≥99.5%。分别对有辅酶参与的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶催化双底物的酶动力学性质进行研究,并从实验数据回归得到了动力学公式的常数,所得到的羰基还原酶（CR）葡萄糖脱氢酶（GDH）酶催化反应动力学方程可分别表示为:羰基还原酶的产物抑制实验验证了其反应机制为Ordered Bi-Bi反应机理,上述数学模型可以用于描述双酶耦联体系催化（R）-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯还原为6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的过程。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 他汀类药物
• 1.1.1 他汀类药物作用机理
• 1.2 生物催化合成他汀侧链的研究进展
• 1.2.1 以（S/R）-5-羟基-3-羰基己酸醋为底物
• 1.2.2 以（3,5）-二羰基己酸酯为底物
• 1.3 生物催化中辅酶循环再生
• 1.3.1 酶法辅酶再生
• 1.4 双底物双产物酶催化反应动力学
• 1.4.1 顺序反应机制
• 1.4.1.1 有序顺序反应机制
• 1.4.1.2 随机顺序反应机制
• 1.4.2 顺序反应机制动力学
• 1.4.2.1 顺序反应动力学方程
• 1.4.2.2 产物抑制动力学
• 1.4.3 乒乓反应机制
• 1.4.4 乒乓反应机制动力学
• 1.5 本文研究的思路和方法
• 参考文献
• 第二章 羰基还原酶、葡萄糖脱氢酶菌株的发酵培养
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌株
• 2.2.2 实验仪器设备
• 2.2.3 实验药品及试剂
• 2.2.4 培养基成分
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 培养方法
• 2.3.2 细胞生长测定
• 2.3.3 生物量的测定
• 2.3.4 菌体细胞超声破碎
• 2.3.5 比酶活（Specific activity）的测定
• 2.3.5.1 羰基还原酶（Carbonyl reductase,CR）酶活的测定
• 2.3.5.2 葡萄糖脱氢酶（Glucose dehydrogenase,GDH）酶活的测定
• 2.4 结果和讨论
• 2.4.1 标准曲线的绘制
• 2.4.2 种子生长曲线的确定
• 2.4.3 接种量的确定
• 2.4.4 诱导剂加入时间的确定
• 2.4.5 诱导温度的确定
• 2.4.6 诱导剂终浓度的确定
• 2.4.7 诱导表达时间对酶活的影响
• 2.5 本章小结
• 参考文献
• 第三章 生物法不对称还原合成6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 实验仪器设备
• 3.2.3 实验药品及试剂
• 3.2.4 培养基成分
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 培养方法
• 3.3.2 静息细胞的制备
• 3.3.3 菌体细胞超声破碎
• 3.3.4 反应产物光学纯度及转化率的测定
• 3.3.5 分析方法
• 3.3.6 生物法不对称还原生产6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的研究
• 3.3.6.1 底物浓度的选择
• 3.3.6.2 双菌质量比对不对称还原的影响
• 3.3.6.3 菌体总浓度对不对称还原的影响
• 3.3.6.4 温度对不对称还原的影响
• 3.3.6.5 pH对不对称还原的影响
• 3.3.6.6 辅酶（NADP+）浓度对不对称还原的影响
• 3.3.6.7 葡萄糖浓度对不对称还原的影响
• 3.3.6.8 细胞冻干对不对称还原的影响
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 标准曲线的绘制
• 3.4.2 底物浓度的选择
• 3.4.3 双菌质量比对不对称还原的影响
• 3.4.4 菌体总浓度对不对称还原的影响
• 3.4.5 温度对不对称还原的影响
• 3.4.6 pH对不对称还原的影响
• 3.4.7 辅酶（NADP+）浓度对不对称还原的影响
• 3.4.8 葡萄糖浓度对不对称还原的影响
• 3.4.9 细胞冻干对不对称还原的影响
• 3.5 本章小结
• 参考文献
• 第四章 羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶协同催化（R）-1不对称还原反应的酶动力学研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 菌株
• 4.2.2 实验仪器设备
• 4.2.3 实验药品及试剂
• 4.2.4 培养基成分
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 培养方法
• 4.3.2 静息细胞的制备
• 4.3.3 菌体细胞超声波破碎
• 4.3.4 蛋白浓度的测定
• 4.3.5 反应初速度的测定
• 4.3.5.1 羰基还原酶（Carbonyl reductase,CR）反应初速度的测定
• 4.3.5.2 葡萄糖脱氢酶（Glucose dehydrogenase,GDH）酶活的测定
• 4.3.6 羰基还原酶产物抑制研究
• 4.3.7 数学模型建立及数据分析处理
• 4.3.7.1 双底物酶促反应动力学方程推导
• 4.3.7.2 产物抑制动力学机理
• 4.3.7.3 双酶耦联模型推导
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 标准曲线绘制
• 4.4.2 羰基还原酶催化（R）-1不对称还原反应动力学常数的测定
• 4.4.2.1 初始底物浓度对反应初速度的影响
• i^A'>4.4.2.2 双倒数作图求解K_i^A
• m^A、1/V_max、K_m^B'>4.4.2.3 二次作图求解动力学参数K_m^A、1/V_max、K_m^B
• 4.4.2.4 羰基还原酶催化（R）-1不对称还原反应初速度曲线拟合
• 4.4.3 羰基还原酶产物抑制动力学研究
• 4.4.4 葡萄糖脱氢酶酶催化（R）-1不对称还原反应动力学常数的测定
• 4.4.4.1 初始底物浓度对反应初速度的影响
• i^A'>4.4.4.2 双倒数作图求解K_i^A
• m^A、1/V_max、K_m^B'>4.4.4.3 二次作图求解动力学参数K_m^A、1/V_max、K_m^B
• 4.4.4.4 葡萄糖脱氢酶氧化葡萄糖反应初速度曲线拟合
• 4.4.5 双酶耦联辅酶循环再生催化（R）-1还原反应动力学
• 4.5 本章小结
• 参考文献
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 附件