不同倍性鲫鲤脑垂体细胞结构和HPG轴相关基因的表达及育性研究

论文摘要

世界上首次培育成功的两性可育异源四倍体鲫鲤群体在生物进化和鱼类遗传育种方面都有重要意义。用雄性四倍体鲫鲤与雌性二倍体日本白鲫交配产生了不育三倍体湘云鲫。四倍体、三倍体鱼的形成为不同倍性鱼的生物学比较提供了重要的生物学平台。鱼类的性腺发育与配子成熟主要受到脑-垂体-性腺轴（HPG）为核心的神经和内分泌系统调控,脑分泌促性腺激素释放激素（GnRH）,激发脑垂体分泌促性腺激素（GTH）与性腺表面特异的促性腺激素受体（GTHR）结合,促使性腺分泌性类固醇激素,从而使性腺发育成熟。而脑垂体作为重要的内分泌器官,在内分泌激素调控中具有非常重要的作用。本研究首次比较分析了二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和四倍体鲫鲤脑垂体分泌细胞结构,并对其Gnrh、Gth和Gthr基因的结构及表达进行了比较研究。主要内容如下:1.对不同倍性鲫鲤脑垂体组织化学结构及分泌细胞大小进行比较分析。就同一类分泌细胞而言,三种鱼脑垂体细胞的体积随倍性增加而增大。在繁殖季节,四倍体鱼中腺垂体的GTH细胞所占比例最大,三倍体鱼最少,这与四倍体性腺发育提前,三倍体不育有关;而三倍体鱼STH细胞所占比例最高,四倍体鱼最少,这与三倍体生长速度快,而四倍体生长速度相对缓慢有关。2.对不同倍性鲫鲤GTH、STH细胞的超微结构进行观察,发现四倍体与二倍体鱼的分泌细胞能进行正常的分泌活动。而繁殖季节三倍体鱼GTH细胞中的分泌颗粒的数量远不及同时期的二倍体和四倍体鱼,并且在繁殖季节后也只能观察到少量空泡状结构。推测由于某种因素抑制了分泌颗粒的排出,从而导致三倍体鱼不育。3.对不同倍性鲫鲤Gnrh2 cDNA全长进行克隆和序列分析。三种鱼Gnrh2氨基酸序列与其他鲤科鱼类有较高的同源性。除GnRH2十肽和蛋白水解位点在三种鱼中完全一致外,四倍体鱼与红鲫的GnRH2氨基酸差异要比三倍体鱼与红鲫的差异小,推测是由于红鲫与四倍体鱼具有更近的亲缘关系所致。4.比较研究Gnrh2基因在不同倍性鲫鲤不同组织中的表达情况。Gnrh2基因在三种鱼的中脑、垂体和性腺中均有表达,其转录产物主要定位于中脑的后部,说明Gnrh2基因可能主要起神经递质或神经调节剂的作用,但也参与调节促性腺激素、生长激素等的释放。繁殖季节Gnrh2基因在四倍体鱼中脑的表达水平最高,三倍体鱼最低;而繁殖季节后的情况相反。推测可能与繁殖季节三倍体鱼性腺不能正常发育且繁殖季节后其Gnrh2表达量不能正常下调有关。5.对不同倍性鲫鲤Fshβ和Lhβ基因cDNA全序列进行克隆和同源性分析。三种鱼的两种基因与其他鲤科鱼类同源性较高。此外,三种鱼Fshβ基因均含有13个半胱氨酸残基,推测其通过第一和第二个半胱氨酸残基间的裂解位点使之形成与其他硬骨鱼类似的12个半胱氨酸残基,从而形成6个二硫键。而三倍体和四倍体鱼Fshβ基因第2个糖基化位点的缺失可能影响其空间结构及生物活性。6.比较研究Fshβ和Lhβ基因在不同倍性鲫鲤不同组织中的表达情况。Fshβ和Lhβ基因只在三种鱼的脑垂体中表达,且均定位于中腺垂体区域,说明这三种鱼的促性腺激素主要是由中腺垂体的GTH细胞产生。繁殖季节,三种鱼Lhβ基因的表达量及分布范围均比Fshβ大,说明Lhβ在促进配子及性腺最终成熟过程中起主要作用。此外,繁殖季节四倍体鱼Fshβ和Lhβ基因表达水平略高于二倍体,可能与其性成熟年龄提前有关。而繁殖季节后三倍体鱼两个基因的表达量要高于二倍体与四倍体鱼,可能是下游因子的反馈调控抑制其表达量下调。7.对不同倍性鲫鲤Fshr和Lhr基因的表达进行比较研究。三种鱼Fshr和Lhr基因均只在精巢和卵巢中表达,并主要定位于卵巢的滤泡细胞、颗粒细胞、放射膜外层及精巢的支持细胞、间质细胞,说明它们都与促进性腺发育及配子成熟有关。但三倍体鱼性腺中两种基因的表达量相对较少,导致GTHR与GTH结合的能力下降,不能产生足够的类固醇激素促进性腺的正常发育,并最终造成三倍体不育。总之,上述结果说明不同倍性鱼脑垂体结构及Gnrh、Gth和Gthr基因表达存在的差异与三倍体不育及四倍体可育有关联,这也为探讨四倍体可育性和三倍体不育性的内分泌学机制提供细胞生物学及分子生物学依据。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 异源四倍体鲫鲤及三倍体湘云鲫的产生及特性
• 1.1.1 异源四倍体鲫鲤的产生及特性
• 1.1.2 三倍体湘云鲫的产生及特性
• 1.1.3 异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫获得的生物学意义
• 1.2 鱼类脑垂体结构研究进展
• 1.2.1 脑垂体组织学和组织化学研究
• 1.2.2 脑垂体超微结构研究
• 1.3 促性腺激素释放激素的研究进展
• 1.3.1 GnRH肽的多态性
• 1.3.2 GnRH肽的结构
• 1.3.3 GnRH肽的分布及功能
• 1.3.4 GnRH基因表达与调控
• 1.4 促性腺激素的研究进展
• 1.4.1 硬骨鱼类GtH类型
• 1.4.2 GtH的结构特征
• 1.4.3 GtH的生理功能
• 1.4.4 GtH的表达调控
• 1.5 促性腺激素受体的研究进展
• 1.5.1 硬骨鱼类GTHR类型
• 1.5.2 FSHR和LHR的结构特征
• 1.5.3 FSHR和LHR的信号途径
• 1.5.4 FSHR和LHR的表达和功能
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第二章 不同倍性鲫鲤脑垂体细胞组织化学研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 组织化学观察
• 2.1.3 垂体细胞体积测量分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 脑垂体组织学结构
• 2.2.2 脑垂体组织化学结构
• 2.2.3 脑垂体细胞及核体积比较
• 2.2.4 嗜酸、嗜碱性细胞所占比例分析
• 2.3 讨论
• 第三章 不同倍性鲫鲤脑垂体细胞超微结构观察
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 超微结构观察
• 3.1.3 不同倍性鱼的性腺组织切片观察
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 脑垂体超微结构观察
• 3.2.2 不同倍性鱼繁殖季节的性腺观察
• 3.3 讨论
• 第四章 不同倍性鲫鲤Gnrh2基因cDNA全序列克隆及遗传分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 不同倍性鱼Gnrh2基因部分cDNA序列的克隆及分析
• 4.2.2 不同倍性鱼Gnrh2基因3′-RACE和5′-RACE结果
• 4.2.3 同源性分析
• 4.2.4 进化树分析
• 4.3 讨论
• 第五章 Gnrh2基因在不同倍性鲫鲤组织中的表达差异分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 Gnrh2基因在同种鱼不同组织中RT-PCR扩增结果
• 5.2.2 Gnrh2基因在不同倍性鱼中脑中的原位杂交定位分析
• 5.2.3 Real-time PCR分析不同倍性鱼中脑Gnrh2基因的表达差异
• 5.2.4 性腺结构的组织学观察
• 5.3 讨论
• 第六章 不同倍性鲫鲤Gthβ亚基cDNA全序列克隆及遗传分析
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 实验方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 不同倍性鱼Fshβ、Lhβ基因的部分cDNA序列的克隆及分析
• 6.2.2 不同倍性鱼Fshβ和Lhβ基因cDNA序列全长
• 6.2.3 同源性分析
• 6.2.4 进化树分析
• 6.3 讨论
• 第七章 Gthβ亚基在不同倍性鲫鲤组织中的表达差异分析
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 实验材料
• 7.1.2 实验方法
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 Fshβ和Lhβ基因在同种鱼不同组织中RT-PCR扩增结果
• 7.2.2 Fshβ和Lhβ基因在不同倍性鱼脑垂体中的原位杂交定位分析
• 7.2.3 Real-time PCR分析不同倍性鱼脑垂体中Fshβ和Lhβ基因的表达差异
• 7.2.4 性腺结构的组织学观察
• 7.3 讨论
• 第八章 不同倍性鲫鲤Gthr基因cDNA部分序列克隆及表达分析
• 8.1 材料与方法
• 8.1.1 实验材料
• 8.1.2 实验方法
• 8.2 结果与分析
• 8.2.1 不同倍性鱼Fshr和Lhr基因部分cDNA序列的克隆及分析
• 8.2.2 不同倍性鱼Lhr基因3′-RACE结果
• 8.2.3 同源性分析
• 8.2.4 Fshr和Lhr基因在同种鱼不同组织中RT-PCR扩增结果
• 8.2.5 Fshr和Lhr基因在不同倍性鱼性腺中的原位杂交定位分析
• 8.3 讨论
• 第九章 总结
• 参考文献
• 主要实验试剂和仪器
• 主要生物信息学软件
• 博士学习期间撰写、发表的主要论文
• 致谢