论文摘要
芝麻（Sesamum indicum L.,2n=26）属于胡麻科胡麻属,是世界上重要的优质油料作物之一。前人研究证实芝麻品种间杂交F1在产量、品质、抗逆性等方面具有较强的杂种优势,利用杂种优势是提高芝麻单产和品质的重要途径。由于芝麻具有种植密度大、无限花序等特点,在生产上只有通过雄性不育系才能大面积配制杂交种。河南省农业科学院对Osman和Yermanos发现的第一个有实用价值的芝麻雄性核不育材料进行了改良,于20世纪80年代末实现了芝麻核雄性不育两系制种,但制种过程中须拔除母本行中50%的可育株,工作量大,限制了芝麻杂交制种的规模和杂交种的应用。为了深入了解芝麻核不育机理、探索核不育保持新途径、提高制种效率,本研究以芝麻核雄性不育系ms86-1为材料,全面系统地开展了包括核不育败育过程的超微结构观察、各种激素含量的动态变化测定、雄性不育相关基因的克隆三个方面的基础研究。结果如下:1、核雄性不育败育过程的超微结构观察运用透射电子显微镜对芝麻核雄性不育系ms86-1的可育和不育花药进行了超微结构的比较观察。根据小孢子的细胞学形态特征,将芝麻花粉发育过程划分为小孢子母细胞形成期、减数分裂期、四分体期、单核小孢子早期、单核小孢子中期、单核小孢子晚期、花粉成熟期7个时期。对比观察结果表明,芝麻核雄性不育的败育迹象起始于小孢子母细胞形成期,并伴随着进一步发育,败育现象逐渐明显:小孢子母细胞形成期孢母细胞壁形状不规则;减数分裂期孢母细胞壁严重扭曲变形,质膜外缺少早期外壁成分—原基粒棒;四分体时期胼胝质壁外沉积物异常,呈绒毛状;四分体解体后形成畸形小孢子,小孢子外壁不健全,绒毡层异常肥厚、降解延迟,释放极少量的畸形乌氏体;随后小孢子愈发皱缩,胞质凝集,内含物减少并逐渐凝聚成一团电子致密物质,最终走向完全败育。2、核雄性不育败育过程中激素含量的动态变化利用ELISA方法测定孢原细胞分化期、花粉母细胞形成期、减数分裂至四分体期、单核小孢子早期、单核小孢子中期和单核小孢子晚期6个时期可育与不育花药中的内源激素含量。结果表明:不育花药中IAA含量在花粉母细胞形成后的各个时期明显亏缺;GA3含量在减数分裂期保持低水平,延迟至单核早期（此期已出现明显败育现象）出现剧增,而可育花药GA3含量在减数分裂期剧增达峰值;ZR含量在减数分裂期至四分体期和单核小孢子中期亏缺最明显,不足可育花药的一半;ABA含量在减数分裂至单核中期明显低于可育系,在单核晚期剧增超过可育含量。在可育、不育花药中,4种激素含量的这种差异在败育现象出现的时期达最大值,说明花药激素含量异常与雄性不育密切相关。3、雄性不育相关基因的克隆通过差异显示试验获得40条在可育、不育花药中差异表达的片段。经BLASTX比对、半定量RT-PCR验证,筛选出4条在可育花药与不育花药表达水平上存在显著差异的片段进行深入研究,这4个片段均在可育花药中强表达,这表明这些基因的表达量不足可能与雄性不育的发生有关。BLASTX比对结果显示:1条与木葡聚糖内转葡糖基酶（xyloglucan endotransglucosylase,XET）同源性达74%,1条与小热激蛋白（smallheat shock protein,HSP）同源性达79%,另外2条与GRAs（GRAS命名来源于首批获得的三个成员:GIBBERELLIC ACID INSENSITIVE,（?）AI;REPRESSOR OF GA1,（?）G（?）;SCARECROW,（?）CR）转录因子蛋白同源性很高。2条差异表达片段均为GRAS转录因子,暗示GRAS转录因子可能与雄性不育有关,我们通过差异显示和5’RACE分析试验分别获得400bp和510bp的片段,但仍不完整,这两个基因还有待于进一步研究。通过同源克隆和5’RACE方法获得木葡聚糖内转葡糖基酶基因全长,命名为SiXET。该基因开放读码框长度为879bp,编码292个氨基酸,含有一个30个氨基酸序列的信号肽。荧光定量PCR结果显示该基因在花器官强优势表达,在可育、不育花药中的表达量差异极显著。SiXET是细胞壁合成与降解的关键因子,本试验结果表明该基因可能在芝麻雄性不育小孢子败育过程中起着关键作用,因此我们构建了该基因的pBI121-35s启动子正义载体和RNA干扰（RNAi）载体,为下一步进行芝麻转基因及功能验证奠定了基础。通过5’RACE方法获得小热激蛋白基因全长,命名为SiHSP。该基因开放读码框长度为720bp,编码239个氨基酸,荧光定量PCR结果显示该基因在可育花药和花瓣中强优势表达,在可育、不育花药中的表达量差异极显著。通过构建pET30a（+）-SiHSP原核表达载体,表达出目的蛋白。许多研究表明HSPs与植物雄性不育育性转换有关,因此,该基因功能验证工作将进一步深入研究。