副猪嗜血杆菌安徽株分型及tbpA基因的克隆表达和免疫保护作用的研究

论文摘要

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis, HPS）是猪的革拉斯氏病（Glasser’s disease）的病原体，猪上呼吸道的一种共栖菌，它可在特定条件下侵入机体而引起以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的全身性疾病，该病已经成为影响世界养猪业的最重要的细菌性疾病之一，给养猪业造成了重大损失。目前HPS已鉴定出15个血清型，但仍有大量的分离菌株无法定为任一血清型，同时各血清型之间缺乏有效的交叉保护，这都制约了副猪嗜血杆菌病的有效防控及其疫苗的发展。本研究对安徽地区HPS分离株进行KRG血清型和ERIC-PCR、PCR-RFLP基因型分析，同时在预测HPS TbpA蛋白抗原表位的基础上，将tbpA分段克隆、表达与鉴定，研究表达蛋白的免疫功能。本研究的主要目的是：（1）探讨安徽地区HPS的血清学和分子流行病学特点，为有效防控Glasser’s disease提供科学依据；（2）探讨TbpA蛋白在HPS免疫过程中的作用，为寻找制备高效广谱HPS新疫苗的途径提供理论依据。实验一、HPS安徽分离株KRG血清型及ERIC-PCR、PCR-RFLP基因型多态性研究自安徽省12个地区（或猪场）的发病猪（高热、呼吸困难）分离鉴定了18株HPS，采用KRG、ERIC-PCR、PCR-RFLP对其进行血清型和基因型分析。结果显示，18株HPS中有10株可以确定血清型，其中以血清型4型最为流行，占27.78%（5/18），其次为14型和13型分别占16.67%（3/18）和11.11%（2/18），此外尚有44.4%（8/18）的菌株不能进行定型。ERIC-PCR将18株HPS分为11个基因型，其中IV为优势基因型，占27.78%（5/18），其次是II基因型和I基因型，分别占16.67%（3/18）和11.11%（2/18）；PCR-RFLP将18株HPS分为6个基因型，其中优势基因型为DBP、BAE和BBB，分别占44.44%（8/18）、22.22%（4/18）和16.67%（3/18）；不能进行血清学分型的菌株均得到有效的基因分型。结果表明，HPS在安徽地区猪群中普遍存在，血清型、基因型均呈多态性分布，HPS的KRG血清型、ERIC-PCR基因型、PCR-RFLP基因型三者之间均无明显的相关性，而ERIC-PCR基因型与同一血清型菌株的来源相关，更能反映菌株的亲缘关系，从分子水平上揭示不同菌株的遗传距离，尤其是应用于病原在猪场的场内及场间的流行情况研究。实验二、HPS tbpA基因的克隆、表达及其免疫保护作用的研究参照GenBank上登陆的HPS SH0165株tbpA基因序列，设计一对特异性引物，采用PCR方法扩增HPS（LJ3株）的tbpA基因，并预测其信号肽序列及主要的抗原表位，以不破坏其优势抗原表位的原则，将tbpA基因分为三段，分别设计引物，经PCR扩增后克隆到pET-32a（+）表达载体中，成功构建了重组表达载体pET-32a（+）-tbpA1、pET-32a（+）-tbpA2和pET-32a（+）-tbpA3，转化BL21后进行诱导表达，经SDS-PAGE电泳可见大小分别为62kD、54kD、44kD的目的蛋白。三段重组蛋白经免疫印记检测后显示其均具有免疫反应性，能与兔抗HPS（LJ3株）高免血清发生特异性反应。将三段重组蛋白及HPS（LJ3株）甲醛灭活菌体分别免疫小鼠后，用同源菌株对菌体免疫组、三个重组蛋白免疫组及对照组小鼠腹腔攻毒，菌体免疫组及TbpA1能分别提供40%及20%的免疫保护率，而其他蛋白免疫组及对照组全部死亡。抗体杀菌试验结果同样表明，TbpA1蛋白的抗体具有杀菌作用。实验结果表明重组的TbpA1蛋白具有抗感染保护作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 图表目录
• 本论文常用的中英文缩写词
• 文献综述
• 1 病原学
• 2 流行病学
• 3 临床症状和病理变化
• 4 致病机理
• 5 免疫及预防
• 6 问题与展望
• 试验一 HPS 安徽分离株 KRG 血清型及 ERIC-PCR、PCR-RFLP 基因型多态性研究
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 病料来源
• 1.2 主要试剂
• 1.3 引物设计
• 1.4 主要仪器
• 1.5 HPS 的分离培养与鉴定
• 1.6 HPS 热稳定抗原制备
• 1.7 HPS 的血清学分型
• 1.8 HPS 的 ERIC-PCR 分型
• 1.9 HPS 的 PCR-RFLP 分型
• 2 结果与分析
• 2.1 HPS 的分离与鉴定
• 2.2 HPS 的血清学分型结果
• 2.3 HPS 的 ERIC-PCR 分型结果
• 2.4 HPS 的 PCR-RFLP 分型结果
• 3 讨论
• 3.1 安徽地区 HPS 临床分离株的血清型
• 3.2 HPS 血清型与基因型的相关性
• 试验二 HPS tbpA 基因的克隆、表达及其免疫保护作用的研究
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 质粒、菌株
• 1.2 主要试剂及实验动物
• 1.3 引物
• 1.4 主要仪器
• 1.5 SDS-PAGE 电泳配方
• 1.6 tbpA 基因的扩增
• 1.7 tbpA 基因的克隆、序列分析及 TbpA 的生物信息学分析
• 1.8 tbpA1、tbpA2 和 tbpA3 基因原核表达载体 pET-32a（+）-tbpA1、pET-32a（+）-tbpA2 和 pET-32a（+）-tbpA3 的构建
• 1.9 重组 TbpA1、TbpA2 和 TbpA3 蛋白的表达、鉴定与纯化
• 1.10 兔抗 HPS 及 TbpA1，TbpA2 和 TbpA3 蛋白血清的制备
• 1.11 重组蛋白对小鼠免疫保护效力的试验
• 1.12 HPS 菌体及 TbpA1，TbpA2 和 TbpA3 蛋白抗体杀菌试验
• 1.13 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 tbpA 基因的扩增
• 2.2 pMD18-T-tbpA 重组克隆质粒的鉴定
• 2.3 tbpA 基因的序列分析及 TbpA 蛋白的生物信息学分析
• 2.4 tbpA1、tbpA2 和 tbpA3 三段基因的扩增
• 2.5 原核表达载体 pET-32a（+）-tbpA1、pET-32a（+）-tbpA2 和 pET-32a（+）-tbpA3 的 鉴定
• 2.6 重组蛋白的表达、鉴定与纯化
• 2.7 兔抗 HPS 及 TbpA1、TbpA2 和 TbpA3 蛋白血清的制备
• 2.8 重组蛋白对小鼠的免疫保护效力的研究
• 2.9 抗体杀菌试验
• 3 讨论
• 3.1 HPS tbpA 基因的扩增及 TbpA 蛋白生物信息学分析
• 3.2 TbpA1、TbpA2 和 TbpA3 蛋白的表达
• 3.3 TbpA1、TbpA2 和 TbpA3 蛋白的免疫保护作用
• 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 在读期间发表的论文