PEG交联云细胞瓣多信号复合材料生物学性能研究

论文摘要

第一部分：PEG交联去细胞瓣复合材料构建及其体外生物相容性目的：PEG交联去细胞瓣构建复合材料,并评价其体外生物相容性。方法：（1）合成功能团为丙烯酰基的枝化状PEG,同时在去细胞瓣上引入巯基,通过丙烯酰基与巯基发生迈克尔加成反应,构建PEG交联去细胞瓣复合材料。（2）生物力学测试评价PEG交联对去细胞瓣机械性能的影响；CCK-8法检测复合材料浸提液对人脐静脉内皮细胞增殖率影响,以评价其生物相容性。结果：复合材料构建条件温和、效果确切；复合材料抗拉强度明显高于去细胞瓣（P<0.05）,且与天然瓣膜抗拉强度相比,差异无统计学差异（P>0.05）。复合材料与去细胞瓣毒性评级均为0级,与阴性对照组相比,差异无统计学意义（P>0.05）；人脐静脉内皮细胞在含复合材料浸提液的培养液中形态良好,增殖旺盛。结论：PEG交联去细胞瓣的方法能够构建与天然瓣膜相似抗拉强度且无细胞毒性的复合材料。第二部分：PEG交联去细胞瓣多信号复合材料构建第一节：构建RGD-复合材料目的：评价PEG交联去细胞瓣复合材料结合粘附肽（精-甘-天冬氨酸RGD肽）的可行性和有效性。方法：复合材料与1ml不同浓度（1.5mg/ml, 1mg/ml,0.5mg/ml,0.25mg/ml）GRGDSPC肽溶液在37℃反应,在不同时间点（1h,2h,4h）,用分光光度法检测复合材料结合GRGDSPC肽质量,并行免疫荧光定性检测,去细胞瓣作为阴性对照。结果：GRGDSPC肽能有效地结合于复合材料,且一片复合材料与lml GRGDSPC肽（1mg/ml）在37℃条件下反应2h,结合GRGDSPC肽质量最大为（0.79±0.01）mg。结论：PEG交联去细胞瓣复合材料,能够在体外有效地结合RGD肽,构建RGD-复合材料。第二节：构建VEGF-复合材料目的：评价PEG交联去细胞瓣复合材料结合血管内皮细胞生长因子（VEGF）的可行性和有效性。方法：复合材料与1ml不同浓度（500pg/ml, 1000pg/ml,2000pg/ml） VEGF溶液在37℃反应,在不同时间点（1h,2h,4h,12h）,用ELISA法检测复合材料结合VEGF质量,并行免疫荧光检测,去细胞瓣作为阴性对照。结果：VEGF能有效地结合于复合材料,且一片复合材料与1ml VEGF （1000pg/ml）在37℃反应4h,其结合VEGF质量最大为（896.87+3.27）pg。结论：PEG交联去细胞瓣复合材料,能够在体外有效地结合VEGF,构建VEGF-复合材料。第三节：构建PEG交联去细胞瓣多信号复合材料目的：评价PEG交联去细胞瓣复合材料同时结合RGD肽和VEGF的可行性和有效性。方法：复合材料与1ml反应液（包含1mg/mlGRGDSPC肽和1000pg/mlVEGF）在37℃反应4h,对反应后复合材料行免疫荧光检测,去细胞瓣作为阴性对照。结果：GRGDSPC肽和VEGF能同时有效地结合于复合材料。结论：PEG交联去细胞瓣复合材料,能够在体外有效地结合RGD肽和VEGF,构建PEG交联去细胞瓣多信号（RGD、VEGF）复合材料。第三部分：PEG交联去细胞瓣多信号复合材料生物学性能研究第一节：内皮祖细胞分离、培养与鉴定目的：分离、培养、鉴定脐带血内皮祖细胞,为其作为组织工程种子细胞提供实验依据。方法：密度梯度离心法分离新鲜脐血中单个核细胞,在含碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子培养液中培养,通过形态学、免疫荧光和流式细胞仪等对贴壁细胞进行鉴定；并与脐静脉内皮细胞进行增殖和迁移能力比较。结果：随培养时间延长,贴壁细胞形态发生明显改变,从小圆变成梭形,逐渐形成特征性克隆和典型成熟内皮细胞鹅卵石样形态；体外培养7天后,90%以上贴壁细胞呈Dil-ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ双染阳性；贴壁细胞流式细胞仪分析显示：培养7 d的细胞VEGFR-2、CD34和CD133表达分别占（77.35+4.86）%、（52.42+6.64）%和（19.36+2.14）%,培养28天的细胞VEGFR-2和CD34表达分别占（81.06+7.31）%和（7.62±3.14）%,而未检测到CD133表达；人内皮祖细胞增殖和迁移能力明显高于人脐静脉内皮细胞<0.05)。结论：用密度梯度离心法和贴壁筛选法,可成功分离出脐带血内皮祖细胞,该方法简单、经济、可行；且内皮祖细胞可向内皮细胞分化,增殖和迁移能力强,有望成为理想种子细胞。第二节：PEG交联去细胞瓣多信号复合材料生物学性能测定目的：研究PEG交联去细胞瓣多信号（RGD、VEGF）复合材料对内皮祖细胞粘附和增殖的影响,为进一步构建TEHV提供依据。方法：A组去细胞瓣,B组PEG交联去细胞瓣复合材料,C组VEGF-复合材料,D组为RGD-复合材料,E组PEG交联去细胞瓣多信号（RGD、VEGF）复合材料。然后在各组材料上种植EPCs,分别在种植后2h、4h、8h用细胞计数和3H-TdR掺入法检测各组材料上细胞数和每分钟脉冲数,反映EPCs在各组材料上粘附性；分别在种植后2d、4d、8d,用细胞计数和3H-TdR掺入法检测各组瓣膜支架上细胞数和每分钟脉冲数,反映各组材料上EPCs增殖情况。在种植8d时,取各组瓣膜支架行苏木素-伊红染色和扫描电镜,以检测EPCs在各组材料上生长情况,并取E组支架材料上细胞行RT-PCR检测t-PA和eNOS的表达,以评价新内皮抗血栓形成功能。结果：（1）种植后2h、4h、8h时各组细胞数和每分钟脉冲数为：D组>E组>C组>A组>B组,其中A组与B组之间各个时间点均无统计学差异（P>0.05）,8h时D组与E组之间的差异无统计学意义（P>0.05）,其余时间点各组之间的差异均有统计学意义（P<0.05）。（2）种植2d、4d、8d时各组细胞数和每分钟脉冲数为：A组均大于B组（P>0.05）,C组、D组和E组均大于同一时间点A组和B组（P<0.05）；种植2d时,E组>C组（P<0.05）,D组>E组（P>0.05）；种植4d时,E组>D组（P<0.05）,D组>C组（P<0.05）；种植8d时,E组>D组（P<0.05）,D组>C组（P>0.05）。（3）苏木素-伊红染色和扫描电镜检测显示：种植8d后,与其它组相比,E组瓣膜支架上可见一致密融合细胞层,并且该新内皮层细胞t-PA和eNOS表达与人脐静脉内皮细胞相似。结论：PEG交联去细胞瓣多信号（RGD、VEGF）复合材料上RGD肽和VEGF,能够协同促进内皮祖细胞在复合材料上粘附和增殖,有利于TEHV构建。

论文目录

• 英汉缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 第一部分: PEG交联去细胞瓣复合材料构建及其体外生物相容性
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4. 结论
• 参考文献
• 第二部分: PEG交联去细胞瓣多信号复合材料构建
• 第一节: 构建RGD-复合材料
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3.讨论
• 4 结论
• 第二节: 构建VEGF-复合材料
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第三节: 构建PEG交联去细胞瓣多信号复合材料
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 第三部分: PEG交联去细胞瓣多信号复合材料生物学性能研究
• 第一节:内皮祖细胞分离、培养与鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3.讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 第二节: PEG交联去细胞瓣多信号复合材料生物学性能测定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 结论、创新与展望
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 在读期间参与申请的专利
• 在读期间相关发表文章
• 致谢