蓝藻Na～+/H～+ Antiporter基因的遗传转化研究

论文摘要

由高盐浓度引起的离子平衡紊乱和渗透胁迫是影响植物生长发育和造成作物减产的主要环境因子。 SynNhap基因是从蓝藻（Synechocystis pcc6803）中克隆得到的,编码质膜Na+/H+逆向转运蛋白,全长1581bp（不包括终止密码子）,编码527个氨基酸,该基因在发挥耐盐性方面有重要作用。本研究利用农杆菌介导的植物遗传转化方法,将SynNhap基因转到番茄和苜蓿中,同时检测了转SynNhap基因烟草F1代的耐盐性及几种保护酶的活性。其主要研究结果如下: （1） F1代转基因烟草耐盐性的检测。通过对不同NaCl浓度下的发芽率、生存率、叶绿素含量、Na+含量及耐盐性表现的检测,结果表明:转基因烟草的发芽率、生存率、叶绿素含量均较对照高,Na+含量较对照有所下降,并且转基因烟草在200mM NaCl处理下,仍能正常存活生长,而对照烟草的生长却受到抑制。 （2） F1代转基因烟草的过氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）含量、细胞膜通透性的检测。随着NaCl浓度的逐渐增加,转基因烟草和对照的SOD、POD和CAT活性均呈现先升后降的变化趋势,但总体来说,转基因烟草三者的活性比对照要高;MDA含量和质膜通透性则呈增加趋势,但转基因烟草增加的幅度比对照要低些。由此推测:转SynNhap基因烟草耐盐性的提高可能与保护酶活性的提高有关。 （3） 番茄的遗传转化。利用农杆菌介导的叶盘法,选取子叶为外植体,获得转SynNhap基因番茄的再生植株,经过PCR检测,发现该基因已经整合到番茄的染色体上。 （4） 苜蓿的遗传转化。利用农杆菌介导的叶盘法,选取子叶为外植体,现已获得大量的抗性愈伤组织,并且在愈伤组织上有绿色的突起（似分化状）,尚未得到分化完全的再生植株。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略表
• 第一章 前言
• 一 盐胁迫对植物的伤害及植物耐盐的分子机理
• 1 盐胁迫对植物的伤害
• 1.1 抑制种子的萌发
• 1.2 盐分对植物生长发育的影响
• 1.3 植物光合作用的抑制
• 1.4 渗透胁迫的伤害
• 1.5 营养胁迫的伤害
• 1.6 盐分对质膜的伤害和活性氧的影响
• 2 植物耐盐的分子机理
• 2.1 细胞内的渗透调节机制
• 2.2 离子平衡调节机制
• 2.3 清除活性氧的膜保护系统
• 2.4 其它机制
• 二 植物耐盐基因工程
• 1 耐盐基因的遗传转化
• 1.1 转渗透调节物质合成的关键酶基因
• 1.2 转清除活性氧的酶基因
• 1.3 转转录因子基因
• 1.4 转编码逆向转运蛋白基因
• 2 植物的遗传转化
• 2.1 农杆菌转化的载体系统
• 2.2 农杆菌转化系统的优点
• 2.3 影响农杆菌介导的植物转化的因素
• +／H⁺逆向转运蛋白研究进展'>三 Na⁺／H⁺逆向转运蛋白研究进展
• +／H⁺逆向转运蛋白的发现'>1 Na⁺／H⁺逆向转运蛋白的发现
• +／H⁺逆向转运蛋白分子的结构'>2 Na⁺／H⁺逆向转运蛋白分子的结构
• +／H⁺逆向转运蛋白与植物耐盐性的关系'>3 Na⁺／H⁺逆向转运蛋白与植物耐盐性的关系
• 四 本研究的主要目的及研究内容
• 1 本研究的主要目的
• 2 主要研究内容
• 第二章 转SynNhap基因烟草耐盐性的检测
• 一 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂及仪器
• 2 方法
• 2.1 分子检测
• 2.2 发芽率的检测
• 2.3 植物的存活率
• 2.4 叶绿素含量的测定
• 2.5 耐盐性表现
• +含量的测定'>2.6 Na⁺含量的测定
• 二 结果与分析
• 1 分子检测
• 2 盐胁迫下转基因烟草的发芽及生存情况
• 3 叶绿素含量的测定
• 4 耐盐性表现
• +含量的测定'>5 Na⁺含量的测定
• 三 讨论
• 第三章 盐胁迫对转SynNhap基因烟草保护酶系统的影响
• 一 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂和仪器
• 2 方法
• 2.1 盐胁迫处理
• 2.2 膜保护酶活性的测定
• 2.3 MDA含量的测定
• 2.4细胞膜透性测定
• 二 结果与分析
• 1.CAT活性变化
• 2.SOD活性变化
• 3.POD活性变化
• 4.MDA活性变化
• 5.叶片质膜通透性的变化
• 三 讨论
• 第四章 农杆菌介导SynNhap基因转化番茄的研究
• 一 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株和质粒
• 1.3 植物激素
• 1.4 培养基
• 1.5 酶和生化试剂
• 1.6 主要实验仪器和设备
• 1.7 常用培养基和溶液的配置
• 2 方法
• 2.1 番茄的组织培养
• 2.2 农杆菌介导的番茄遗传转化
• 2.3 转基因植株的检测
• 二 结果与分析
• 1 重组质粒的酶切鉴定
• 2 pBI121-SynNhap质粒转化农杆菌LBA4404
• 3 GUS活性的组织化学检测
• 4 PCR检测
• 三 讨论
• 1 外源基因在植物转化中的影响因素
• 2 关于转基因植物的筛选问题
• 3 GUS组织化学检测的假阳性
• 4 异源转化具有一定的盲目性
• 第五章 农杆菌介导SynNhap基因转化苜蓿的研究
• 一 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株和质粒
• 1.3 培养基
• 1.4 酶和生化试剂
• 1.5 主要实验仪器和设备
• 1.6 GUS组织化学染色液配制
• 2 方法
• 2.1 苜蓿无菌苗的培养
• 2.2 侵染菌液的制备
• 2.3 感染和共培养
• 2.4 转化体的筛选、继代
• 2.5 GUS活性的组织化学检测
• 二 结果与分析
• 1 培养基的类型和外植体的种类对诱导抗性愈伤组织的影响
• 2 外植体预培养对转化的影响
• 3 GUS检测结果
• 三 讨论
• 1 培养基的类型和外植体的种类对诱导抗性愈伤组织的影响
• 2 外植体预培养对转化效率的影响
• 3 其它因素对转化效率的影响
• 4 本研究的现状
• 第六章 SynNhap基因原核表达的研究
• 一 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 常规菌种和质粒
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 电泳缓冲液
• 2 方法
• 2.1 SynNhap基因原核表达载体的构建
• 2.2 将重组质粒pTWIN1-SynNhap转化受体菌ER2566
• 2.3 SynNhap基因的诱导
• 2.4 检测SynNhap基因的表达
• 二 结果与分析
• 1 SynNhap基因原核表达载体的构建
• 2 SynNhap基因的诱导表达及表达产物的SDS-PAGE分析
• 三 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 图版Ⅰ 番茄遗传转化过程图示
• 图版Ⅱ 苜蓿子叶侵染后获得抗性愈伤组织的过程图示