枳CBF与GFP融合基因的构建及其转化烟草与枳

论文摘要

温度是影响植物生长和分布的重要因素。周期性寒害往往引起柑橘果实产量降低、品质下降,甚至树体死亡,从而造成巨大的经济损失。迄今为止,全球的柑橘冻害问题仍然没有得到有效解决。因此培育柑橘的抗寒品种成为柑橘业中一个急需解决的问题。随着植物分子生物学的发展,转基因已成为农作物育种新的技术,植物的抗寒性状是复杂的数量性状,是低温下多基因共同协作的结果。若采用单一的抗寒基因转化植物,虽然能一定程度上提高转基因植物的抗寒性,但实际效果并不理想。CBF是一种调控一系列植物冷驯化相关基因表达的转录因子,在低温下迅速合成,与相应顺式作用元件CRT/DRE结合,诱导冷相关基因的表达,进而合成糖类、脯氨酸和膜稳定蛋白等物质,提高植物的抗寒性。因此,利用CBF转化柑橘有望成为培育柑橘抗寒新品种的有效途径。枳由于具有抗性强、树形矮小等特点,是柑橘的常用砧木。枳也是柑橘中抗寒性最强的品种,可以耐-20℃。所以研究柑橘的抗寒基因首先研究枳的抗寒基因。为了更好地利用所分离得到的枳CBF基因来提高柑橘的抗寒性,了解其功能特征与表达模式是必要的。研究基因的表达,必须选择合适的启动子。已有研究报道了枳CBF基因及其自身启动子的序列,本研究参考此报道克隆了枳CBF,在其自身启动子的启动下与报告基因GFP构建成融合基因,并构建融合基因表达载体,在农杆菌介导下转入到烟草及枳中,观察枳CBF的时空表达模式。主要试验结果如下:①构建融合基因CG。以枳DNA为模板,将枳CBF及其自身启动子作为一个完整的序列克隆出来,扩增产物5′端引入EcoRI酶切位点,3′端引入SalⅠ酶切位点。以PMV质粒为模板,扩增GFP,在5′端引入SalⅠ酶切位点,在3′端增加BstpⅠ酶切位点。将扩增的CBF与GFP序列分别用SalⅠ进行单酶切、连接。在此过程中注意融合基因移码问题,扩增产物经测序验证为目的融合基因,命名为CG。全长为2.4 kb,是一个由枳CBF基因自身启动子、枳CBF与GFP构成的融合基因。②构建融合基因表达载体CG2301。以表达载体pCAMBIA2301为基础载体,用EcoRⅠ、Bstp分别双酶切pCAMBIA2301与融合基因CG后,T4 ligase连接,构建成融合基因表达载体CG2301。此载体含枳CBF与GFP的融合基因CG,并由枳CBF自身启动子启动表达,为Kan抗性。③融合基因表达载体CG2301在农杆菌介导下采用叶盘法转化烟草,获得了43棵生根的抗性苗,经PCR鉴定,获得13株转基因烟草。④融合基因表达载体CG2301在农杆菌介导下采用上胚轴转化枳,取其中的14株抗性芽进行PCR鉴定,获得2株转基因枳。⑤研究融合基因CG在烟草中的表达模式。将转基因烟草在4℃与-5℃温度处理不同的时间后,通过荧光显微镜观察基因在不同的器官中的表达情况。结果表明,荧光首先在根系表达（在4℃下2h、-5℃下15min即可检测到）,其次是在叶片（4℃下12h、-5℃下15min有少量荧光）,茎中的表达最晚（4℃下48h、-5℃下30min有少量荧光）。在叶片中荧光首先出现在叶脉处,随着处理时间的增加,表达量也在增加,若叶片出现伤口,则伤口周围会检测到大量的荧光。在根和茎中同样随着低温处理时间的增加荧光量不断加强。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表（Abbreviation）
• 第一章 文献综述
• 1 柑橘冻害现状分析
• 2 基因工程技术改善柑橘抗寒性
• 2.1 冷驯化相关的细胞变化
• 2.1.1 细胞膜结构的变化
• 2.1.2 细胞抗氧化系统的变化
• 2.1.3 钙信号系统的变化
• 2.2 冷驯化过程中的分子水平变化
• 2.3 柑橘遗传转化的研究
• 2.4 报告基因的选择
• 3 本课题的提出和目的
• 第二章 融合载体的构建
• 1 材料与试剂
• 2 方法
• 2.1 枳DNA的提取及检测
• 2.1.1 CTAB大量法提取枳DNA
• 2.1.2 DNA质量检测与浓度测定
• 2.2 PtCBF及其启动子克隆
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 PCR扩增PtCBF及其启动子
• 2.2.3 产物回收、克隆及测序
• 2.2.3.1 目的片段回收
• 2.2.3.2 目的片段与pMD18-T载体连接
• 2.2.3.3 大肠杆菌感受态细胞制备
• 2.2.3.4 转化及蓝白斑筛选
• 2.2.3.5 质粒提取（碱裂解法）
• 2.2.3.6 双酶切及PCR鉴定
• 2.2.3.7 测序
• 2.3 GFP的克隆
• 2.3.1 引物设计
• 2.3.2 模板PMV质粒的制备
• 2.3.3 PCR扩增GFP序列
• 2.3.4 产物回收、克隆及测序
• 2.3.4.1 目的片段回收
• 2.3.4.2 目的片段与pMD18-T载体连接
• 2.3.4.3 连接载体转化大肠杆菌及蓝白斑筛选
• 2.3.4.4 质粒提取
• 2.3.4.5 双酶切及PCR鉴定质粒
• 2.3.4.6 测序
• 2.4 融合基因CG的构建
• 2.4.1 酶切CBF
• 2.4.2 酶切GFP
• 2.4.3 构建融合基因CG
• 2.4.3.1 连接酶切片段
• 2.4.3.2 连接片段纯化及转化T载体
• 2.4.3.3 双酶切与PCR鉴定
• 2.5 融合基因表达载体CG2301的构建
• 2.5.1 酶切基础表达载体pcAMBIA2301
• 2.5.2 酶切融合基因CG
• 2.5.3 纯化、连接酶切后的载体片段及融合基因片段
• 2.5.4 连接载体转化大肠杆菌及蓝白斑筛选
• 2.5.5 质粒提取
• 2.5.6 双酶切及PCR鉴定
• 2.5.7 测序
• 3 结果与分析
• 3.1 PtCBF及其启动子的克隆
• 3.1.1 枳基因组DNA的提取
• 3.1.2 PtCBF及其启动子的扩增
• 3.1.3 阳性克隆的鉴定
• 3.1.4 枳CBF及其启动子序列的测序结果
• 3.2 GFP的克隆
• 3.2.1 质粒PMV的提取
• 3.2.2 PCR扩增GFP序列
• 3.2.3 阳性克隆的鉴定
• 3.2.4 GFP序列的测序结果
• 3.3 构建融合基因CG
• 3.3.1 PCR扩增CG
• 3.3.2 阳性克隆的鉴定
• 3.3.3 CG序列的测序结果
• 3.4 融合基因表达载体CG2301的构建
• 3.4.1 基础载体pCAMBIA2301的提取
• 3.4.2 酶切融合基因CG与基础表达载体pCAMBIA2301
• 3.4.3 融合基因表达载体CG2301的构建及验证
• 4 讨论
• 第三章 枳CBF转化烟草
• 1 材料与试剂
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株与质粒
• 1.3 主要试剂
• 1.4 激素和抗生素贮存液的配制
• 1.5 培养基
• 2 方法
• 2.1 无菌苗的组织培养
• 2.2 烟草的遗传转化
• 2.2.1 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.2 融合基因表达载体CG2301转化农杆菌
• 2.2.3 农杆菌的活化和制备
• 2.2.4 烟草共培养
• 2.2.5 选择分化培养
• 2.2.6 选择生根培养
• 2.2.7 烟草叶片总DNA的提取
• 2.2.8 PCR检测转基因烟草
• 2.3 低温处理转基因烟草及荧光检测
• 3 结果与分析
• 3.1 转化材料的准备
• 3.2 烟草叶盘法遗传转化
• 3.3 转基因植株的鉴定
• 3.3.1 转基因烟草植株基因组DNA的质量检测
• 3.3.2 转基因烟草PCR鉴定
• 3.4 低温处理转基因植株的荧光检测
• 3 讨论
• 第四章 枳CBF转化枳
• 1 材料与试剂
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株与质粒
• 1.3 主要试剂
• 1.4 培养基
• 2 方法
• 2.1 转化材料的准备
• 2.2 枳的遗传转化
• 2.2.1 侵染菌液的制备
• 2.2.2 枳上胚轴预培养
• 2.2.3 侵染与共培养
• 2.2.4 筛选培养、再生
• 2.2.5 枳叶片总DNA的提取
• 2.2.6 PCR检测转基因枳
• 3 结果与分析
• 3.1 枳遗传转化
• 3.2 转基因植株的鉴定
• 3.2.1 转基因枳抗性芽DNA的质量检测
• 2.3.2 转基因烟草PCR鉴定
• 4 讨论
• 4.1 选择合适的外植体类型进行转化
• 4.2 采用最佳的培养再生体系
• 参考文献
• 附录
• 附录一 序列测序结果
• 附录二 烟草的遗传转化
• 附录三 低温处理后转烟草中枳CBF的荧光表达
• 附录四 枳的遗传转化过程
• 致谢