红背叶根有效部位提取及体外抗乙肝病毒作用机制研究

论文摘要

中文摘要红背叶根作为岭南地区常用的中草药之一,主要用于治疗与肝脏相关的疾患。以红背叶根提取物为原料的固体口服制剂具有抗肝炎病毒和阻止肝纤维化的作用,但目前尚未见关于其化学成分、药理作用方面的文献报道,转基因HepG2.2.15细胞株载有HBV全基因组,能够进行病毒复制并稳定分泌感染性病毒颗粒及HBsAg和HBeAg,因此被广泛用于抗病毒药物的筛选和疗效评价。我们以HepG2.2.15细胞作为靶细胞,采用MTT比色法观察红背叶根水提物,醇提物,生物碱含药血清对HepG2.2.15细胞的毒性作用；并分别采用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法测定细胞培养上清中HBsAg, HBeAg的含量,以此评价红背叶根提取物体外抗HBV的作用。现先报告如下：实验一：HepG2.2.15细胞株培养体系的建立目的使HepG2.2.15细胞正常生长,为红背叶根水提物,醇提物,生物碱含药血清干预实验做准备。方法分为细胞复苏、细胞培养、细胞传代、细胞冻存四个步骤。结果细胞复苏后三周内生长速度较缓慢,但传代后生长状态良好,可用于药物干预实验。实验二：细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg分泌曲线的绘制目的观察HepG2.2.15细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的分泌情况。方法HepG2.2.15细胞经传代培养,在其贴壁后1-6d分别收集细胞培养上清液,-20℃保存,统一检测。使用ELISA法检测细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg,显色反应后,酶标仪读取A450nm值,绘制分泌曲线。结果HepG2.2.15细胞在贴壁后1-6d,其培养上清液中的HBsAg和HBeAg通过酶标仪所测的A 450nm值逐渐增大,分泌曲线呈现逐渐上升趋势。实验三：红背叶根各种提取物制备及含药血清制备目的制备红背叶根各种提取物及其含药血清。方法1.红背叶根各种提取物制备红背叶根各种提取物制备：红背叶根采自广东惠州,经南方医科大学中药鉴定与药用植物教研室鉴定为大戟科植物红背山麻杆Alchornea trewioides（Benth.） Muell.-Arg.的根。100%红背叶根制剂,取红背叶根原药材加8倍水,加热回流2h,残渣再加8倍水加热回流2h,合并提取液后过滤,浓缩成体积与原药材质量比为1/1的流浸膏。按药效学原则制成水溶液含生药量10.4g/kg,冷藏备用。红背叶根醇提物制备：100%红背叶根制剂,取红背叶根原药材加8倍量95%乙醇,用加热回流2h,残渣再加8倍乙醇加热回流2h,合并提取液,回收乙醇,得到乙醇提取物,按与原药材的比例配置成一定浓度混悬水液,（含生药量0.45g/ml）,冷藏备用。生物碱提取：红背叶根粗粉500g,95%乙醇浸泡6h后,回流提取2次,每次120分钟,合并2次滤液,然后加入1/2体积,5%盐酸,分离出杂质及酸水提取液,酸水提取液中加入浓氨水碱化,调节PH到9,得到非生物碱部位和游离生物碱部位,游离生物碱部位,用CHCL3萃取三次,分别按1：1,1：2,1：3体积萃取,得到水相及生物碱部位,蒸馏水洗脱3次后,旋转蒸发回收氯仿,得到总生物碱部位,取该部位少许加入4支小试管,各管依次加入生物碱沉淀剂：碘化钾、碘化汞钾、硅钨酸试剂和碘化铋钾各2滴。该部位出现不同程度沉淀反应,分别为：棕红色,白色,白色,桔红色。说明该部位部位含有生物碱成分,重0.22g,按药效学原则制成水溶液含生药量0.44g/kg。2.红背叶根各种提取物含药血清的制备54只健康Wistar雄性大鼠适应性喂养1周后,称重,随机分为9组,每组6只,通过给予大鼠分别灌服红背叶根水提物低剂量,红背叶根水提物中剂量,红背叶根水提物高剂量,红背叶根醇提物低剂量,红背叶根醇提物中剂量,红背叶根醇提物高剂量,生物碱,恩替卡韦和生理盐水7天后,分离药物血清,制红背叶根水提物低剂量、红背叶根水提物中剂量、红背叶根水提物高剂量、红背叶根醇提物低剂量、红背叶根醇提物中剂量、红背叶根醇提物高剂量、生物碱、阳性对照恩替卡韦和空白血清,血清经56℃,30min灭活,置-20℃冰箱保存,待测备用。结果：各组含药血清质地均匀,清稀合格,可用于药效干预实验。实验四：药物对细胞的毒性实验目的采用MTT方法,观察各种红背叶根各种提取物含药血清对HepG2.2.15的细胞毒性作用。方法HepG2.2.15细胞购自博慧斯生物医药有限公司,取第4-8代细胞,以1×104个/L,每孔200gL接种于96孔培养板,随机分为10组,细胞贴壁后各组换入相应含药血清：红背叶根水提物低剂量组,红背叶根水提物中剂量组,红背叶根水提物高剂量组,红背叶根醇提物低剂量组,红背叶根醇提物中剂量组,红背叶根醇提物高剂量组,生物碱组,阳性对照恩替卡韦组,阴性对照组和空白对照组,每组5孔。阴性对照组换入正常培养液。于加药d3吸去上清液,每孔加5g/L MTT 10μL,37℃孵育4h,弃上清液后每孔加入DMSO 150μL,震荡10min,测A450nm值；通过公式计算细胞抑制率和半数中毒浓度（TC50）。结果红背叶根水提物低、中、高剂量组含药血清对细胞的抑制率分别为53.7%,39.3%,26.1%,红背叶根醇提物低、中、高剂量组含药血清对细胞的抑制率12.7%,11.1%,生物碱组含药血清为8.2%,空白对照组为6.1%,西药组4.2%,生物碱组含药血清的TC50为0.67g/L；恩替卡韦组含药血清对细胞的抑制率为43.4%。在此实验中,生物碱组含药血清对细胞的抑制与空白对照组差异无统计学意义（P>0.05）；生物碱组含药血清和恩替卡韦组含药血清在细胞毒性上差异无统计学意义（P>0.05）。实验五：细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的测定目的观察红背叶根水提物,醇提物,生物碱含药血清对HepG2.2.15细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的影响。方法使用ELISA法检测细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg,显色反应后,酶标仪读取A450nm值；通过公式计算抗原抑制率和50%药物抑制浓度（IC50）。结果红背叶根各种提取物组相对于阴性对照组,其所测A450nm值均降低,且随着药物浓度的增加,培养时间的延长,降低愈明显。0.025g/L红背叶根生物碱组在d6细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg与阴性对照组差异有显著统计学意义（P<0.01）,而其他浓度组在d3,d6两个时间段细胞培养上清中HBsAg和HBeAg分泌量均和阴性对照组差异有显著统计学意义（P<0.01）。在d6,红背叶根对细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的IC50分别为0.096g/L和0.085g/L。结果：1、HepG2.2.15细胞能向培养上清液中稳定地分泌HBsAg和HBeAg,其分泌量随着细胞培养时间的延长而逐渐增加。2、红背叶根生物碱含药血清对HepG2.2.15细胞的毒性较小,TC50为0.67g/L。3、红背叶根水提物,醇提物,生物碱对HepG2.2.15细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的分泌均有一定的抑制作用,且随作用时间的延长,抑制也随之增强。4、红背叶根提取物生物碱在体外具有抗HBV的作用；而且从治疗指数来看,属于有效低毒药物。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 文献回顾
• 一、现代医学对慢性乙型肝炎的认识
• 二、中医学对肝脏病的认识
• 三、中医药抗HBV研究进展
• 四、红背叶根化学成分及药理作用
• 五、中药含药血清血清药理学研究进展
• 六、HepG2.2.15细胞研究进展
• 第二部分 正文
• 实验一 HepG2.2.15细胞株培养体系的建立
• 实验二 HBeAg、HBsAg分泌曲线的绘制
• 实验三 红背叶根各有效部位提取及含药血清制备
• 实验四 药物对细胞的毒性实验
• 实验五 上清液中HBsAg和HBeAg的测定
• 全文小结
• 参考文献
• 附录 中英文缩略词表
• 攻读学位期间成果
• 致谢
• 统计学证明