苯并咪唑类化合物通过抑制NLRP3炎症小体治疗DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎

论文摘要

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）是一种原因尚不清楚的非特异性慢性肠道炎症性疾病,其病变涉及直肠和结肠或全结肠（全结肠炎）,呈连续性分布,临床主要表现为腹泻、腹痛和黏液脓血便。溃疡性结肠炎不仅影响着患者的生活质量,甚至能导致结肠癌的发生。目前溃疡性结肠炎的主要治疗方法是以抗炎和调节免疫反应为主,一些免疫抑制药物被用来治疗肠炎,比如水杨酸类药物、强的松、环孢素A、他克莫司及TNF抑制剂等。然而不可避免的,以上治疗方法都有一定的毒副作用包括肾脏毒性、固醇类依赖性以及严重的感染。因此,高效、低毒的肠炎治疗药物亟待发。在第一章中,我们对炎症小体研究进展以及NLRP3炎症小体在炎症性疾病中的作用进行了综述。NLRP3炎症小体参与了多种炎性疾病的发生和发展,可能可以作为药物研究的靶点。在第二章中,我们以经典的THP-1炎症小体细胞模型对一批小分子化合物IL-1p的释放抑制活性进行了筛选并得到了活性最好的化合物（Fc11a-2）。同时在硫酸葡聚糖（DSS）诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型中考察了Fc11a-2的治疗效果。实验结果表明Fc11a-2的给药能够明显改善DSS导致的小鼠体重下降、腹泻、便血、死亡以及结肠结肠病理评分的增高。同时Fc11a-2能够有效抑制DSS模型小鼠结肠组织中髓过氧物酶（MPO）的表达以及炎性细胞因子蛋白水平以及mRNA水平的表达。在DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎中,MAPK、STAT1以及NF-κB信号通路都处于活化的状态。Fc11a-2的给药能够抑制上述通路的活化。我们进一步检测了Fc11a-2对DSS诱导的急性肠炎模型中NLRP3炎症小体活化的影响,发现Fc11a-2能抑制模型中NLRP3炎症小体活化。在第三章中,我们对Fc11a-2抑制NLRP3炎症小体活化的作用机理进行了探讨。Fc11a-2能剂量依赖性的抑制THP-1细胞模型上IL-1β、IL-18分泌,抑制caspase-1活化及caspase-1酶活,但是对ASC、NLRP3的表达没有影响。Fc11a-2对于NLRP3炎症小体活化的第一信号无显著影响,也对ATP刺激引起的线粒体膜电位下降也无明显抑制作用。最后发现Fc11a-2能抑制caspase-1自剪切活化,从而抑制NLRP3炎症小体介导的IL-1β的成熟。综上所述,本论文通过筛选并得到了对IL-1p释放有明显抑制作用的小分子化合物Fc11a-2,证明其对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎有较好的治疗效果,最后阐明了其通过抑制caspase-1活化从而抑制NLRP3炎症小体介导的IL-1p的释放的作用机理。以上研究结果为肠炎治疗药物的研发提供了新思路,同时也对NLRP3炎症小体在肠炎发病中的作用有益参考。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 参考文献
• 第一章 炎症小体活化及其在炎症疾病中的作用
• 绪言
• 第一节 炎症小体研究进展
• 1.1 NLR家族成员介绍
• 1.2 NLRP3炎症小体的活化机制研究进展
• 第二节 NLRP3炎症小体与自身免疫性疾病的关系
• 2.1 NLRP3炎症小体与多发性硬化症
• 2.2 NLRP3炎症小体与糖尿病
• 2.3 NLRP3炎症小体与哮喘
• 2.4 NLRP3炎症小体与痛风
• 2.5 NLRP3炎症小体与炎性肠道疾病
• 参考文献
• 第二章 苯并咪唑类化合物活性筛选及对DSS诱导的小鼠急性肠炎模型治疗效果
• 绪言
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 仪器
• 2.1.3 实验动物
• 2.1.4 细胞株
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型的建立
• 2.2.2 给药方式及剂量
• 2.2.3. 结肠长度及形态
• 2.2.4 组织石蜡切片,H&E染色及评分
• 2.2.5 结肠组织总蛋白的提取及western blot
• 2.2.6 组织髓过氧化物酶活力的测定
• 2.2.7 结肠组织总RNA的提取,RT-PCR及Q-PCR
• 2.2.8 酶联免疫吸附法
• 2.2.9 免疫组织荧光
• 2.2.10 小鼠腹腔巨噬细胞的分离
• 2.2.11 脾脏细胞的制备
• 2.2.12 细胞因子胞内染色
• 2.2.13 统计方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 Fc系列化合物对炎症小体活化中IL-1β释放的抑制
• 2.3.2. Fc11a-2抑制DSS诱导的急性肠炎
• 2.3.3 Fc11a-2改善急性肠炎病理评分以及结肠中MPO的表达
• 2.3.4 Fc11a-2抑制炎性细胞因子在蛋白水平及mRNA水平的表达
• 2.3.5 Fc11a-2抑制结肠组织中MAPK及STAT通路的活化
• 2.3.6 Fc11a-2抑制结肠组织中炎性巨噬细胞的浸润
• 2.3.7 Fc11a-2抑制脾脏细胞中Th1分化
• 2.3.8 Fc11a-2抑制腹腔巨噬细胞中caspase-1的活化
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 参考文献
• 第三章 Fc11a-2通过抑制NLRP3炎症小体的活化机理研究
• 绪言
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 仪器
• 3.1.3 细胞株
• 3.1.4 实验动物
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 酶联免疫吸附法
• 3.2.2 BCA蛋白定量
• 3.2.3 免疫印迹分析
• 3.2.4 caspase-1酶活的检测
• 3.2.5 线粒体膜电位检测
• 3.2.6 免疫共沉淀
• 3.2.7 骨髓来源巨噬细胞的体外分化
• 3.2.8 免疫细胞荧光
• 3.2.9 统计方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 Fc11a-2抑制NLRP3炎症小体活化中IL-1β及IL-18释放
• 3.3.2 Fc11a-2抑制NLRP3炎症小体活化过程中caspase-1的活化
• 3.3.3 Fc11a-2对炎症小体活化第一信号NF-κB的活化没有显著影响
• 3.3.4 Fc11a-2对线粒体膜电位的下降没有显著地抑制效果
• 3.3.5 Fc11a-2抑制caspase-1的自剪切
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 参考文献
• 结语
• 附录一 缩略语表
• 附录二 已发表和待发表论文
• 致谢