论文摘要
花生易受黄曲霉菌的侵染而产生黄曲霉毒素,严重影响了花生的食品安全。花生荚壳和种衣是对抗黄曲霉侵染的重要屏障;花生生长后期是黄曲霉侵染花生的关键时期。改变花生果、种皮的组成结构特征可望培育出抗性品种。长期以来,国内外通过常规育种培育的抗黄曲霉品种皆表现抗性不稳定,且进展缓慢。鉴此本实验室在国际上最早开展了通过基因工程手段以培育抗性品种。为了提高转基因的安全性,先后开展了花生果、种皮特异性表达启动子克隆和无标记转基因技术研究。本文研究利用已克隆的特异启动子构建果皮特异表达载体,用已开发的抗生素诱导删除工具载体构建双价载体,并对以前构建的载体进行转遗传化研究,结果如下。1.利用实验室已有的花生果种皮特异启动子（8#、13#）和CHI基因、GLU基因、COMT基因、RS基因,构建了6个可改变花生果种皮化学组成或增强抗性的植物表达载体。2.利用实验室已有的果种皮特异启动子（8#、13#和S19#）驱动CHI基因、GLU基因、CBF2基因、RS基因的单价载体和基于Cre-loxP的抗生素诱导删除工具载体,构建了2个植物表达双价载体,分别命名为:pLoxp-8-CBF2-S19-RS,pLoxp-8-CHI-13-GLU。3.优化了以胚轴为外植体的再生体系和遗传转化体系。芽诱导培养基为MMS+30 mg/L BA+0.5 mg/L 2.4-D时,芽诱导率最高,当伸长培养基为MMS+3 mg/L BA+1 mg/L NAA+2 g/L碳粉伸长率最高;采用逐次筛选,前两周的潮霉素浓度10 mg/L,后两周的潮霉素浓度为20 mg/L潮霉素时,筛选效果最好;生根培养基的潮霉素浓度为1 mg/L时筛选效果最好,培养1428天,当根伸长至34cm时,进行嫁接。4.通过优化的转化体系,转化以上构建的载体及实验室以前保存的载体。得到了转CHI和GLU基因的T0代植株。以上研究所构建的花生果皮特异表达载体和抗生素诱导删除的双价载体,以及优化的转基因技术体系,将为基因工程手段安全解决花生黄曲霉污染问题奠定基础。
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摘要Abstract第一章 黄曲霉毒素的分子生物学研究进展及花生黄曲霉毒素污染防治措施1.1 黄曲霉及其污染的严重性1.1.1 黄曲霉毒素1.1.2 食品安全及经济影响1.2 黄曲霉毒素的生物合成机理1.2.1 黄曲霉生物合成途径的研究进展1.2.2 影响黄曲霉毒素生物合成的因素1.3 黄曲霉毒素污染的防治措施1.3.1 生物防治1.3.2 通过作物育种和基因工程增强寄主抗性1.3.3 功能基因组学在减少黄曲霉毒素污染方面的应用1.3.4 ESTs 的开发和应用1.3.5 黄曲霉功能基因组学1.4 研究展望参考文献第二章 花生抗黄曲霉的植物特异表达载体的构建2.1 前言2.2 材料与方法2.2.1 细菌菌种和质粒2.2.2 PCR 引物的设计2.2.3 表达载体的构建2.3 结果2.3.1 PCR 扩增结果2.3.2 特异植物表达载体的构建和检测结果2.3.3 特异植物表达载体的测序结果2.4 讨论2.4.1 关于转基因安全性的考虑2.4.2 CHI 基因对黄曲霉的抗性作用2.4.3 GLU 基因对黄曲霉的抗性作用2.4.4 COMT 基因对黄曲霉的抗性作用2.4.5 RS 基因对黄曲霉的抗性作用参考文献第三章 花生抗黄曲霉的植物双价表达载体的构建3.1 前言3.2 材料与方法3.2.1 细菌菌种和质粒3.2.2 试剂3.2.3 PCR 引物的设计3.2.4 表达载体的构建3.3 结果3.3.1 PCR 扩增结果3.3.2 中间载体的构建和检测结果3.3.3 双价载体的构建和检测结果3.3.4 植物表达载体的测序结果3.4 讨论参考文献第四章 花生遗传转化及筛选体系的优化4.1 前言4.2 材料与方法4.2.1 植物材料和细菌菌种4.2.2 外植体的制备4.2.3 再生体系的建立4.2.4 筛选条件的确定4.3 结果4.3.1 生长调节剂对对多重芽形成的影响4.3.2 植物生长调节剂对再生芽增殖和生根的影响4.3.3 嫁接4.3.4 潮霉素筛选压的确定4.4 讨论4.4.1 外植体的选择4.4.2 延迟筛选培养对转化的影响4.4.3 嫁接的优势参考文献第五章 花生抗黄曲霉表达载体的转化5.1 前言5.2 材料与方法5.2.1 植物材料和细菌菌种5.2.2 花生的遗传转化和再生5.2.4 PCR 阳性分析5.3 结果5.3.1 共培养结果5.3.2 丛生芽诱导结果5.3.3 抗性芽筛选结果5.3.4 抗性芽的伸长与生根结果5.3.5 抗性植株PCR 检测结果5.4 讨论参考文献附录一 部分测序结果致谢
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标签：花生论文; 转基因论文; 果种皮特异启动子论文; 抗黄曲霉论文; 表达载体论文;
