论文摘要
目的：肝动脉栓塞化疗术（transcatheter arterial chemoembolization, TACE）是目前治疗不能手术的原发性肝癌（primary hepatocellular carcinoma, HCC）的主要方法,可以延长患者的生存期,但TACE治疗通常不能使病灶完全坏死,且术后患者免疫功能受到损伤。近年来,随着细胞免疫学和分子生物学的发展,肝癌的细胞免疫治疗已经开始在临床应用,并取得了很好的疗效,其中以树突状细胞（dendritic cells, DC）和细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cells, CIK）为基础的抗肿瘤免疫治疗以其独特的优势,成为国内外研究的热点。DC细胞是目前发现的功能最强的专职抗原提呈细胞（antigen presenting cell, APC）, CIK细胞是一种新型免疫活性细胞,兼有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和自然杀伤细胞（natural killer Cell, NK）的非主要组织相关性复合物（Major Histocompatibility Complex, MHC）限制性杀瘤的特点。DC细胞与CIK细胞是肿瘤免疫治疗的两个重要部分,前者识别抗原,激活获得性免疫系统,后者通过发挥自身细胞毒性和分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞。DC细胞与CIK细胞共培养时,两者能相互调节,CIK细胞能促进DC的成熟,同时DC细胞能增强CIK细胞的增殖能力和杀伤活性。本实验将经肝癌细胞HepG2抗原负载的与未经肝癌细胞HepG2抗原负载的白体DC细胞与CIK细胞共培养,观察培养物的细胞表型、增殖能力和杀伤活性的变化,并将DC-CIK应用于经TACE术治疗后的肝癌患者,观察患者免疫功能、生活质量、临床疗效、AFP、HBV-DNA的变化及不良反应,为肝癌的临床生物免疫治疗提供依据。方法1.采集治疗组患者外周血单个核细胞,在体外培养获得DC细胞和CIK细胞,采用流式细胞仪检测细胞表型。制备肝癌细胞株HepG2可溶性抗原,将经抗原负载与未经抗原负载的DC细胞分别与CIK细胞共培养,动态观察细胞的增殖能力及杀伤活性。2.将41例原发性肝癌患者随机分为治疗组和对照组,治疗组20例,先行TACE术,术后给予Ag-DC-CIK治疗,对照组21例,仅行TACE术治疗。3. Ag-DC-CIK治疗结束后用流式细胞仪检测患者外周血T细胞亚群（CD3+,CD4+, CD8+, CD4+/CD8*）,调节性T细胞（CD4+CD25+）及NK细胞（CD16+CD56+）变化,并评价患者的生活质量变化、临床疗效、肿瘤标志物AFP、HBV-DNA的变化及患者的不良反应。结果1.CIK. DC-CIK和Ag-DC-CIK三组培养细胞于第3天天始增殖,第12天进入快速增殖期。其中Ag-DC-CIK组细胞的增殖速度明显快于CIK和DC-CIK组（p<0.05）。2..三组细胞均表达CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞,随着培养时间延长,三组细胞的CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞的百分含量随之升高,其中Ag-DC-CIK组CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞的含量明显高于相同培养时间的CIK组和DC-CIK组（p<0.05）。3. Ag-DC-CIK组共培养细胞在效靶比为20：1时对肝癌细胞HepG2的杀伤活性最高,与CIK组及DC-CIK组比较均具有显著差异（p<0.05）。4. Ag-DC-CIK治疗结束后治疗组CD3+、CD4+、CD16+CD56效应细胞的比例和CD4+/CD8+比值显著升高,CD4+CD25+、CD8+效应细胞比例下降,治疗前后有显著差异（p<0.05）。5.治疗组的完全缓解率、部分缓解率及客观有效率均高于对照组,但无明显差异（P>0.05）。治疗组患者的一般状况较对照组得到明显改善（p<0.05）。6.治疗组AFP≥400ug/L的患者中有69.2%AFP降至400ug/L,明显高于对照组（p<0.05）7.治疗组HBV-DNA阳性（>103/L）的患者中有60%出现HBV-DNA转阴,与对照组比较有显著差异（P<0.01）。8.治疗组Ag-DC-CIK治疗结束后有2例患者出现寒战、发热,一般在38℃左右,对症处理后可缓解,未见过敏、休克等不良反应,亦未见骨髓抑制、肝肾受损等。结论1.肝癌细胞抗原致敏的DC细胞与CIK细胞共培养,其主要效应细胞为CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞；抗原负载的DC细胞能明显增强CIK细胞的增殖活性；抗原负载的DC细胞与CIK细胞共培养后对肝癌细胞HepG2的杀伤作用最强。2.晚期原发性肝癌患者TACE间歇期经Ag-DC-CIK细胞治疗后,大多数患者的一般情况得到明显改善,T细胞亚群比例失调的状况得到不同程度的改善,肿瘤得到有效控制,生活质量得到明显提高,未见明显不良反应,具有较高的安全性。