论文摘要
肌腱病（Tendinopathy）的发病率极高,是骨科、运动医学、康复医学、职业病防治和老年医学的常见疾病。肌腱病严重影响人们的工作与生活,特别影响运动员竞技水平的发挥,常迫使优秀运动员提早退役。肌腱病的主要临床表现为肌腱或肌腱-骨胳连接处的疼痛、压痛甚至断裂、关节活动度受限。肌腱腱病最常见的发病部位依次为髌腱、跟腱、冈上肌腱肩袖、指深屈肌腱及肱骨外上髁伸肌总腱止点。足底筋膜炎、跟腱炎、髌腱炎、网球肘、高尔夫肘、冈上肌腱炎都是肌腱病。虽然肌腱病如此常见,其发病机制仍不清楚,常认为与肌腱韧带的急慢性损伤有关。新近发现的肌腱干/祖细胞（Tendon stem/progenitor cells, TSPCs）,也称为肌腱干细胞（tendon stem cells, TSCs）或肌腱源性干细胞（tendon-derived stem cells, TDSCs）,经传代培养后可直接成为腱细胞,具有成体干细胞的自我复制和诱导成脂、成软骨、成骨分化的潜能,是腱细胞的前体细胞。研究表明,TSCs参与肌腱的急慢性损伤修复,是肌腱急慢性损伤修复过程中的关键效用细胞。不同剂量的反复循环机械应力刺激可影响肌腱干细胞力学生物学行为,进一步导致肌腱内环境的稳态和肌腱病的发生。应用体外循环机械牵伸系统模拟细胞在体反复机械应力状态,证明4%的机械拉伸能增加TSCs增殖、促进TSCs成为腱细胞,然而8%的机械拉伸可诱导TSCs分化为脂肪、软骨和骨细胞。可见,小的机械拉伸（有序和适度的体育锻炼）可促进TSCs增殖并成为腱细胞,有利于肌腱的强壮及肌腱的健康；而持续较大的机械负荷（如过度劳损）是有害的,它促使肌腱干细胞分化为非腱细胞,导致脂肪堆积、黏液形成和肌腱钙化,表现为肌腱病的典型病理变化。可见,TSCs可能是探索肌腱病的突破口。因为对肌腱病还没有本质认识,临床治疗还往往是经验性的。治疗方法包括：局部制动休息、减负训练、按摩冷疗、离心型运动、口服非甾体类抗炎药物、局部注射富血小板血浆（platelet-rich plasma, PRP）、细胞疗法、体外冲击波术、严重时可给予糖皮质激素等治疗。对于保守治疗无效、临床症状持续较重者,可给予外科手术治疗。在这些治疗方法中,PRP局部注射具有自体来源、制作简单、可制作成凝胶状、临床使用安全、方便、经济等优点,倍受医生和患者的欢迎。因此,临床应用PRP局部注射治疗“肌腱病”值得我们关注。PRP是全血经过梯度离心分离获得的、含有超过基线水平的浓缩血小板血浆。一般而言,血小板含量至少要达到正常血的3-5倍才能称之为PRP。当PRP被激活后,其血小板释放出大量的生长因子,包括血小板衍生生长因子（PDGF）,转化生长因子p（TGF-p）,血管内皮细胞生长因子（VEGF）,纤维生长因子（FGF）,内皮细胞生长因子（EGF）,血小板衍生内皮细胞生长因子（PDEGF）,胰岛素样生长因子（IGF）等。这些生长因子对细胞的增殖和分化有着重要的作用,能够刺激损伤组织血管神经化、为细胞修复或再生损伤组织提供血供和营养。体外研究已经发现PRP能促进TSCs增殖和成腱细胞形成,动物实验研究也已证实这一结果,一些临床试验也已经验证PRP能够促进肌腱和韧带急慢性损伤的愈合和有效治疗肌腱病。然而,PRP局部注射治疗肌腱和韧带的急慢性损伤和肌腱病并不总是令人满意,有一些临床试验却发现PRP对肌腱和韧带急慢性损伤的修复和肌腱病的治疗无益。因此,应用PRP治疗肌腱病仍需进一步基础与临床研究。我们知道,临床应用的PRP是个体化准备的,没有明确的定义。因而,每一个人的PRP都可能不一样,并且在某些情况下,有些病人不能成功获得PRP。仔细分析PRP的制备过程及其组成成份,我们发现只有两类（共有4种）不同的PRP在临床使用：其中一类含白细胞（L-PRP和L-PRF）,另一类不含白细胞（P-PRP、P-PRF）。有研究发现应用富含白细胞的PRP有较乏白细胞的PRP更为严重的急性炎症反应。因为TSCs是肌腱急慢性损伤修复的关键效用细胞,我们假设L-PRP不利于肌腱和韧带的愈合是因为L-PRP会抑制TSCs的正常活性。本课题为证实上述假设共分为3章,即肌腱干细胞的分离、培养和鉴定；P-PRP和L-PRP的制备和鉴定；P-PRP和L-PRP对TSCs增殖、分化和细胞力学的影响。研究目的是为临床合理应用PRP局部注射治疗肌腱病提供理论依据。第一章兔肌腱干细胞的分离、培养及鉴定目的：分离和鉴定兔肌腱干细胞（TSCs）并评估其干细胞特性为下一步实验做准备。研究内容包括：（1）TSCs的分离及培养；（2）TSCs的克隆形成能力及增殖能力检测；（3）TSCs的流式细胞仪及免疫荧光鉴定；（4）TSCs的成脂、成软骨、成骨分化能力测定。方法：从新西兰大白兔中获取TSCs已经匹兹堡大学实验动物应用学会批准（IACUC批准号：1105545A）。选用3月龄健康雄性新西兰大白兔。兔处死后从后肢的跟腱取细胞并进行TSCs培养,观察克隆形成、进行干细胞鉴定和到P3后行成脂、成软骨、成骨诱导。结果：体外培养7天后,肌腱来源细胞（Tendon-derived cells, TDCs）已经形成克隆。流式细胞术对细胞表面抗原标志进行了分析,结果显示TDCs表面抗原干细胞标志CD90、CD44均呈强阳性。免疫荧光的方法对干细胞特征性标志物（NS, Nanog, Oct-4, SSEA4）进行了检测,染色细胞经免疫荧光显微镜观察。结果显示80%的TDCs细胞均表达阳性。成脂诱导分化后,细胞增殖缓慢,细胞中出现脂滴,并逐渐增大、融合,油红-O染色可见细胞内大小不等的红色脂滴。成软骨诱导分化4周,固定细胞,经番红-O染色,细胞微团被染为红色。成骨诱导分化4周后,TDCs细胞呈层叠样生长,局部出现钙盐沉积,形成矿化结节,钙盐沉积处Alizarin red S染色成红色。小结：本研究获取的TDCs是肌腱干细胞（TSCs）,具有克隆形成能力及快速增殖能力,细胞表面抗原CD90、CD44表达呈阳性,而CD34表达呈阴性,干细胞特异性标志物NS、Nanog、SSEA4和OCT-4表达阳性,在成骨、成脂和成软骨诱导条件下,可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等,具有多向分化潜能,可用于下一步研究。第二章P-PRP和L-PRP的制备及P-PRP及L-PRP对TSCs的影响为了明确是否是PRP中的白细胞影响了PRP的疗效,本研究将分别制备P-PRP和L-PRP及研究P-PRP与L-PRP对TSCs的作用,以进一步确定L-PRP对肌腱韧带修复的不利影响,明确P-PRP对肌腱韧带修复的积极作用。方法：选用3月龄、体重2.5kg的健康雄性新西兰大白兔8只（匹兹堡大学实验动物中心提供,IACUC Protocol number:1105545A）,乙醚麻醉后,在严格无菌条件下,用预先含有3.8%ACD抗凝剂（sodium citrate）溶液的注射器从心脏采集新鲜抗凝血并置于冰水混合物中。小心缓慢地将6mL的新鲜血注入盛有6mL Polymorphprep （Accurate Chemical&Scientific Crop NY）的试管中,置4℃离心机中予以400g/m离心30分钟后手工分离出P-PRP和L-PRP,应用自动细胞计数仪（Nexcelom Bioscience LLC, Lawrence, Massachusetts）对P-PRP和L-PRP所含的白细胞进行计数。P-PRP和L-PRP均用22mM CaCL2进行激活并存于4℃冰箱中备下一步实验用。将准备好P-PRP和L-PRP培养基和普通培养基,培养基中除含或未含P-PRP或L-PRP外,其他成分一样（20%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、低糖DMEM）,分析各培养基中的细胞因子；将兔来源的TSCs接种在含P-PRP、L-PRP （0%,2%,5%,10%）培养基或普通培养基的6孔培养板中（10000个细胞／孔）并在37℃、5%CO2条件下培养;培养至1、2、4天观察细胞形态,至第4天用自动细胞计数仪（Nexcelom Bioscience LLC, Lawrence, Massachusetts）行细胞计数并计算PDT,流式细胞仪检测其干细胞特征性细胞表面标志物;观察P-PRP组、L-PRP组和对照组TSCs经成脂、成软骨和成骨诱导28天后其多分化潜能；qRT-PCR分析P-PRP和L-PRP对TSCs基因表达的影响,PRP与白细胞对TSCs的相互影响；CTFM测定P-PRP和L-PRP对TSCs细胞力学的影响。结果：加入离心液一次梯度离心可制备高浓度的PRP。PRP中的血小板量为1.44×108±0.84×108/mL（P<0.05）,与全血比较,其血小板浓缩率为3.25±0.73。P-PRP中的白细胞数为0.6625×105±0.36×105/mL,L-PRP中的白细胞数为3.2775×105±1.22×105/mL（P=0.019）（mean±SD, n=8）。所有培养基（P-PRP培养基、L-PRP培养基和普通培养基）均在配制好后即用ELISA法测定其生长因子（PDGF, EGF, TGF-β1, VEGF）的浓度。P-PRP培养基有较L-PRP培养基和普通培养基更高浓度的生长因子,特别是EGF和TGF-β1。L-PRP培养基中VEGF浓度较普通培养基还低,说明白细胞可能抑制PRP释放生长因子（P-PRP与L-PRP培养基比较,P<0.05,n=3）；L-PRP培养基组不贴壁细胞增加；其干细胞特征性细胞表面标志物CD44和CD90发生变化,经P-PRP处理,CD44和CD90都表达增加,经L-PRP处理则相反（P-PRP与L-PRP组比较,P<0.05,n=3）；PDT与PRP白细胞的浓度有关,当增加P-PRP的浓度或降低L-PRP浓度时,PDT缩短（组内和组间比较,P<0.05,n=3）：培养4天、14天后,L-PRP的浓度越高,Nang、Oct4基因表达越下调（L-PRP组内和L-PRP组与P-PRP组比较,P<0.05,n=3）；经28天的成脂、成软骨和成骨诱导后,P-PRP培养基组、L-PRP培养基组和普通培养基组的TSCs均被成功诱导。然而,L-PRP培养基组阳性细胞染色数明显较P-PRP培养基组和普通培养基组。与P-PRP培养基组和普通培养基组比较,L-PRP培养基组成脂、成软骨和成骨分化明显增加（组内比较,P<0.05,n=3）；各基因与P-PRP和L-PRP的浓度密切相关。L-PRP的存在,PPARγ、SOX-9、Runx-2、mPGEs基因表达就明显上调。（L-PRP组内和L-PRP组与P-PRP组比较,P<0.05,n=3）；L-PRP培养基组的最大细胞收缩力明显小于P-PRP培养基组和普通培养基组,组间比较有显著性差异（P=0.006、0.002,n=5）,但P-PRP培养基组与普通培养基比较则未见显著性差异（P=0.609、0.002,n=5）；WBC组的COX-1和COX-2基因明显上调,但WBCs的这种作用可以明显被PRP抵消；PRP组Ⅰ型胶原基因（Col-Ⅰ）表达上调,但这种作用可以明显被WBC处理抑制；WBC组还明显有MMP-13基因表达的增加,这种表达增加可以被PRP抵消。小结：本研究中通过加入离心液一次梯度离心分离制备出P-PRP和L-PRP,其所含的白细胞有显著的差异。与P-PRP和空白对照比较,L-PRP会抑制TSCs的增生、加速TSCs的分化、并使TSCs脆性增加；经WBCs处理后,TSCs的炎症反应介质基因COX-1和COX-2表达增加,细胞分解代谢的基因Ⅰ型胶原表达减少但MMP-13表达增加。这些发现支持临床所见的肌腱病发病机制,因而,我们可以合理地推断P-PRP可以促进肌腱韧带的愈合而L-PRP可能抑制肌腱韧带的愈合。因此,我们应该用P-PRP而不是含有白细胞的L-PRP治疗肌腱病。第三章P-PRP胶-TSCs复合物的构建及TSCs的体内、外示踪将P-PRP胶作为载体负载TSCs构建成P-PRP胶-TSCs复合物并植入目标部位,并监测TSCs植入体内后其生物学活性。方法：应用SPIO标记TSCs、分析SPIO对TSCs生物学功能的影响；构建P-PRP胶-TSCs复合物；体外MRI观察经SPIO标记的TSCs在P-PRP胶内的分布情况；建立兔髌韧带窗式缺损模型,用P-PRP胶-TSCs复合物进行修复,MRI连续检测追踪经SPIO标记的TSCs并检验P-PRP胶作为载体的可行性；免疫荧光检测评价P-PRP胶-TSCs植入体内3周后其TSCs的Ⅰ型胶原合成能力,以观察TSCs植入体内3周后的生物学性能；明确P-PRP胶作为TSCs载体用于治疗急慢性肌腱损伤和肌腱病的可行性。结果：我们发现TSCs经胞吞作用摄入SPIO,可见SPIO在细胞浆内并围绕在细胞核周围。细胞标记率约98%。经SPIO标记的TSCs细胞形态未见明显改变；细胞增殖也未见明显改变,表现为PDT与未标记TSCs比较无显著性统计学差异（P>0.05）,说明SPIO标记不会影响细胞的增殖功能；分别于标记后2、4、7天检测细胞的活力,发现其活力都在90%左右,与未标记细胞比较也无明显差异,说明SPIO标记不会明显干扰TSCs的细胞活力（P>0.05）；经免疫组织化学方法证实SPIO标记组TSCs和未标记组nucleostemin和Nanog表达率都为约90%,没有明显差别（P>0.05）；经qRT-PCR检测,我们发现标记TSCs和未标记TSCs相比,在标记后4、7、14天,其Oct-4和Nanog基因表达都没有明显差别（P>0.05）;经21天的成脂、成软骨和成骨分化,两组未见明确差异；其PPAR、Sox9和Runx2基因表达也无明显差异（P>0.05）。体夕P-PRP胶-TSCs复合物经3T MR扫描发现经SPIO标记的TSCs其MRI信号与标记细胞数呈线性改变,说明TSCs可均匀分散在P-PRP胶中；体内P-PRP胶-TSCs复合物经3T MR扫描发现经SPIO标记的TSCs连续3周其MRI信号没有明显变化。术后3周局部表现为肌腱缺损已有组织填充,经普鲁氏兰染色证实MRI显影的细胞就是经SPIO标记的TSCs,说明TSCs能持续停留在目标部位至少3周。从组织修复的角度考虑,3周的时间足于完成急性炎症期,目的细胞能停留在目标部位3周以上就可能发挥其生理功能,达到治疗目的。再次,经免疫组织化学染色证实P-PRP胶负载的TSCs在体内3周后出现明显的Ⅰ型胶原的表达,说明TSCs已经发挥生理作用。可见P-PRP胶可以作为TSCs细胞治疗或组织工程的载体。小结：用SPIO标记TSCs不会明显干拢其干性、负载TSCs的P-PRP胶修复兔髌韧带窗式缺损术后2周和3周连续经MRI观察均未见明显影像学改变、经普鲁氏兰染色证实MRI显影的细胞就是SPIO标记的TSCs,说明存在于P-PRP胶内作为目的细胞的TSCs可以稳定维持在目标部位,且TSCs植入体内3周后能合成Ⅰ型胶原,说明TSCs可用SPIO进行标记、P-PRP胶可作为TSCs的良好载体。结论：本研究成功地从兔跟腱分离培养出TDCs。这些细胞有克隆形成能力、快速增殖能力和多向分化潜能,经流式细胞仪证实干细胞表面特征性标志物阳性,经免疫荧光染色证实干细胞特征标志物染色阳性,从而确定为肌腱干细胞；经一次离心可简便制备出较高浓度的PRP并成功分离出P-PRP和L-PRP;发现L-PRP,这种含白细胞的PRP,会抑制。TSCs增殖、加速TSCs分化并使TSCs脆性增加、加大TSCs的细胞炎症反应及细胞分解代谢。或许,我们应该用P-PRP而不是含有白细胞的L-PRP来治疗肌腱病。P-PRP胶是TSCs细胞治疗和肌腱组织工程潜在的良好支架。