固始鸡IL-2基因克隆、表达及其生物活性检测

论文摘要

参照Genebank已发表的基因序列,设计一对引物,应用反转录多聚酶链式反应,从有丝分裂原ConA诱导的幼龄固始鸡脾细胞中扩增出片段为680bp的固始鸡白细胞介素2基因,将扩增片段通过T-A策略连接到克隆质粒pGEM-T载体上,经PCR鉴定、酶切鉴定、和序列测定,证明克隆片段为固始鸡白细胞介素2基因。与网上公布的其它品种鸡白细胞介素2基因序列进行比较,在ORF内仅有二个碱基不同,但其推导的编码氨基酸二级结构完全相同。通过二级结构预测表明,它们编码蛋白前端有22个氨基酸的信号肽序列,4个半胱氨酸形成两个二硫键,并含有4个类似于哺乳动物的α螺旋。IL-2序列分析表明,固始鸡的IL-2与其它品种鸡的IL-2有较高的同源性,从而进一步证明了鸡IL-2具有较强的保守性。 应用重组基因工程技术,将鸡IL-2基因亚克隆到原核表达质粒载体pET28a中,并转化大肠杆菌BL21（DE3）。通过IPTG诱导,在大肠杆菌中表达了重组鸡IL-2蛋白。SDS-PAGE电泳结果显示,其分子量为18KD左右,0.4mM-1.6mM的IPTG对重组质粒诱导表达量无明显差异。37℃诱导5-7小时表达量最多。薄层扫描分析表达量在18%。经超声波裂解离心初步分离,表达产物主要以包涵体形式存在,但在细胞裂解上清中也有一定含量。将包涵体经过初步分离,变性,镍亲和层析柱纯化,复性,对纯化的表达蛋白进行生物学活性检测。MTT试验结果表明,重组固始鸡白细胞介素2对经ConA活化的鸡脾淋巴细胞具有明显的体外增殖作用,从而表明,重组白细胞介素2在免疫增强剂和免疫佐剂方面具有潜在的应用前景。固始鸡IL-2基因的克隆和表达成功,为IL-2进一步作为治疗剂在抗感染、抗病毒和作为疫苗佐剂、构建基因工程活载体疫苗、制备单抗以及促进生长等方面的研究,奠定了基础。另外,IL-2是一种天然细胞功能因子,不造成机体残留,在临床上具有广阔的应用前景,可以解决因添加化学物质和抗生素而造成食品安全问题和耐药菌株的产生,又能在畜禽传染病防治上,增强其免疫和治疗作用。应用基因工程技术对鸡IL-2成功克隆和表达,既具有重大理论意义,同时在实际中又具有较高的应用价值。

论文目录

• 摘要
• 文献综述
• 引言
• 实验一：固始鸡白细胞介素2 cDNA的克隆及序列测定
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 实验二：固始鸡IL-2基因的原核表达
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 实验三：固始鸡IL-2表达产物活性的检测
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 英文摘要