重组大鼠溶菌酶多肽的原核表达、纯化及其生物活性研究

论文摘要

【目的】①重组大鼠溶菌酶C端基因片段在大肠杆菌中高效表达。②分析大鼠溶菌酶C端多肽与晚期糖基化终产物（advanced glycation end products,AGEs）的结合活性。③探讨大鼠溶菌酶N端多肽对AGEs的清除作用及机制。【方法】①采集SD大鼠外周血液,分离白细胞,用Trizol法提取总RNA;用RT-PCR扩增大鼠溶菌酶C端基因片段。②将大鼠溶菌酶的c端基因片段插入载体pET-30a（+）构建重组表达载体pLy70,双酶切鉴定和序列分析。③将重组载体pLy70转入大肠杆菌Rosetta（DE3）中,诱导表达目的多肽并对诱导表达条件进行优化。④SDS-PAGE和Western blotting鉴定Ni+-NTA agarose亲和柱纯化和制备的目的多肽。⑥晚期糖基化牛血清白蛋白的体外制备。⑦双抗夹心ELISA法测定LY70对AGEs的结合活性。⑧细胞实验分析LY77（重组大鼠溶菌酶C端多肽）对AGEs的清除作用以及RT-PCR测定AGEs受体RAGE mRNA表达水平的变化。【结果】1)重组表达质粒构建:①由大鼠白细胞提取的总RNA经EB琼脂糖电泳后出现28S、18S、5S三条带,含量比约为5:3:1,经RT-PCR扩增出210bp条带,大小与预计相符。②构建重组表达质粒pET-30a（+）/LY70,经双酶切鉴定和序列分析,结果与理论预期的完全符合。2)重组大鼠溶菌酶C端基因片段在大肠杆菌中高效表达:①诱导重组质粒转化菌表达出重组多肽LY70,经SDS-PAGE和Western blotting检测分析,LY70主要以可溶性形式存在。②诱导条件优化:在37℃,诱导5小时和IPTG浓度0.2 mmol/L时,LY70在大肠杆菌Rosetta（DE3）中的表达水平可达到最大值,重组多肽LY70含量约为90mg/L,占可溶性蛋白60%以上。3)经Ni+-NTA agarose亲和柱纯化和G-25脱盐,制备出重组多肽LY70通过Maillard反应体外制备晚期糖基化牛血清白蛋白BSA-AGEs。4)双抗夹心ELISA法分析显示,目的多肽LY70与AGEs基本上没有结合作用。5)细胞实验显示,LY77对AGEs有明显的清除作用;同时,LY77能有效地抑制AGEs上调其受体RAGE mRNA表达的作用。【结论】1)成功构建了大鼠溶菌酶重组表达质粒pET-30a（+）/LY70。2)重组大鼠溶菌酶C端基因片段在大肠杆菌Rosetta（DE3）中实现高效表达,重组多肽LY70主要以溶解形式存在。3)重组多肽LY70对AGEs基本上没有结合活性,证明溶菌酶对AGEs的结合位点在其N端附近。4)大鼠溶菌酶N端多肽LY77通过结合AGEs而达到清除后者的作用,同时导致AGEs受体RAGE基因表达减弱。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 溶菌酶简介
• 2 溶菌酶的空间结构
• 第一部分 重组大鼠溶菌酶C端多肽的克隆及原核表达载体的构建
• 1.1 引言
• 1.2 实验材料
• 1.3 实验方法
• 1.4 实验结果与分析
• 第二部分 重组大鼠溶菌酶C端多肽的诱导表达、纯化及其对AGEs的结合活性检测
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.3 实验方法
• 2.4 结果与分析
• 第三部分 重组大鼠溶菌酶N端多肽促进AGEs清除的作用及机制
• 3.0 引言
• 3.1 实验材料
• 3.2 常用溶液的配制
• 3.3 实验方法
• 3.4 结果与分析
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录Ⅰ 英文缩写词简表
• 附录Ⅱ 测序图
• 附录Ⅲ 在校期间发表文章
• 致谢