论文摘要
目的:本课题结合临床建立老年血亏阴虚型失眠证候动物模型,并将该复合型模型与传统单因素睡眠剥夺模型进行对照,遵循中医因-脉-证-治的思路进行评价:首先对“因”进行分析,即根据中医病因病机来评价造模因素的科学性;然后对“脉”进行观测,即观测模型较直接、直观、重要的中医体表特征,并确认这种模型的证候属性;接着对“证”进行探讨,即通过分子生物学等现代科技手段对体表特征所反映的老年血亏阴虚型失眠病理机制进行概括;最后用验方酸枣仁汤“治”来进行反证,探讨对应治法验方酸枣仁汤的作用及其可能机制,并建立基于代谢网络变化的中药复方系统生物学药效评价平台。方法:在对酸枣仁汤的促眠作用进行实验研究之后,将健康Wistar大鼠100只（雌雄各半、体重200g±20g）随机分成5组,每组20只:环境对照组;睡眠剥夺组（单因素模型组）;证候模型组（复合因素模型组）;酸枣仁汤大剂量组;酸枣仁汤小剂量组。其中环境对照组给予其它组睡眠剥夺时相似的水环境;单因素模型组采用自制多平台水环境法剥夺睡眠48h制备;复合因素模型组及酸枣仁汤大、小剂量组均采用颈背部皮下注射D-半乳糖6w、然后腹腔同时注射环磷酰胺和氢化可的松5d、接着用自制多平台水环境法剥夺睡眠48h制备复合模型,造模历时共7w;酸枣仁汤大、小剂量组在造模4w后开始同时灌胃给药3w,其它组均给予等容积生理盐水。指标检测具体方法如下:1、通过同步检测体重、摄食量、腋温、及显微放大拍照爪、尾、口唇等部位,对各组实验大鼠的中医体表特征进行比较;2、用组织化学法检测各组实验大鼠大脑皮质、海马部位自由基和一氧化氮合酶（NOS）水平的变化;3、采用血液细胞分析仪检测各组实验大鼠血细胞计数的变化;4、采用Morris水迷宫实验检测各组实验大鼠学习记忆能力的改变;5、透射电镜下观察各组实验大鼠大脑皮质部位超微结构的病理改变;6、采用高相液相法检测各组实验大鼠大脑皮质及下丘脑部位谷氨酸（Glu）及γ-氨基丁酸（GABA）含量的变化;7、采用免疫组化染色和mRNA半定量RT-PCR法检测分析各组实验大鼠大脑皮质及海马部位γ-氨基丁酸A受体（GABAAR）a1和γ2亚单位的表达改变;8、采用免疫组化染色法检测各组实验大鼠大脑皮质部位星形胶质细胞的表达改变。结果:1、与空白对照组比较,舒乐安定组、酸枣仁汤大、小剂量组均能显著延长阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间（P＜0.01）,显著增加阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡率（P＜0.01）。且酸枣仁汤大剂量组作用比小剂量组更明显,但无统计学意义（P＞0.05）;2、中医体表特征显示,与环境对照组比较,睡眠剥夺组出现失眠症状,表现为重度疲劳状态;与睡眠剥夺组比较,证候模型组在出现失眠症状的同时,出现面色无华,闭目,血呈暗红,嗜睡,食欲明显下降,四肢无力,毛蓬竖少光泽等血亏阴虚体表特征,且体重、摄食量显著下降（P＜0.01）,而腋温的下降无统计学意义（P＞0.05）;与证候模型组比较,酸枣仁汤大、小剂量组对血亏阴虚体表特征有改善作用,但无统计学意义（P＞0.05）;3、与证候模型组比较,其它各组大鼠大脑皮质、海马丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和NOS活性均明显降低（P＜0.01,P＜0.05）。且酸枣仁汤大、小剂量组呈现一定量效关系（P＜0.05）;4、与证候模型组比较,其它各组大鼠全血中红细胞计数、白细胞计数、血小板计数及血红蛋白含量显著升高（P＜0.01）。且酸枣仁汤大、小剂量组呈现一定量效关系（P＜0.05）;5、在定位航行实验中,与证候模型组比较,环境对照组和酸枣仁汤大、小剂量组大鼠实验4d及2d的潜伏期均显著缩短（P＜0.01）。在空间搜索实验中,各组平台象限的游泳距离占总距离百分比、池壁20%和40%区域游泳距离百分比的实验结果表现出与定位航行实验各组一致的趋势;与证候模型组比较,环境对照组和酸枣仁汤大、小剂量组跨过原平台位置次数明显升高（P＜0.01）。两种模型组间相比无明显差异（P＞0.05）;6、睡眠剥夺48h后,透射电镜下显示:睡眠剥夺组大鼠大脑皮质神经元细胞异染质轻微聚集,趋边排列,核周间隙轻微增宽,大部分线粒体中高度水肿,线粒体基质及线粒体脊消失;证候模型组大鼠大脑皮质神经元细胞间胞质水肿,连接增宽,可见单个神经元细胞异染质凝聚,趋边,呈现凋亡形态,细胞器消失;酸枣仁汤大、小剂量组能改善大鼠神经元细胞超微结构的病理改变;7、与环境对照组比较,睡眠剥夺组大鼠大脑皮质及下丘脑部位氨基酸类神经递质Glu、GABA含量均明显增高（P＜0.01）,但GABA增加更为明显,Glu/GABA比例减小;与环境对照组比较,证候模型组大鼠Glu、GABA含量均明显增高（P＜0.01）,但Glu增加更为明显,Glu/GABA比例增大;与证候模型组比较,酸枣仁汤大、小剂量组大鼠大脑皮质及下丘脑部位氨基酸类神经递质Glu、GABA含量显著减少,但Glu减少更为明显,Glu/GABA比例减小,并呈现一定量效关系（P＜0.05）;8、与证候模型组比较,环境对照组和酸枣仁汤大、小剂量组大鼠大脑皮质及海马部位的GABAARa1和γ2亚单位免疫化学累积光密度明显较低（P＜0.01）,皮质部位GABAARa1和γ2mRNA的表达均显著下调（P＜0.01）。而与睡眠剥夺组比较,证候模型组表达相对较弱（P＜0.05）;9、与证候模型组比较,环境对照组和酸枣仁汤大、小剂量组大鼠睡眠剥夺48h后星形胶质细胞标志物—胶原纤维酸性蛋白（GFAP）在皮质部位表达明显较弱;与睡眠剥夺组比较,证候模型组表达亦相对较强。结论:1、酸枣仁汤具有明显的镇静催眠作用,且大剂量作用强于小剂量;2、模型大鼠的体表特征显示,D-半乳糖+环磷酰胺、氢化可的松+睡眠剥夺这一复合模型较接近临床老年血亏阴虚型失眠患者的表现,是一种可行、可靠的复合型动物模型;3、老年大鼠的学习记忆能力和大脑皮质病理损伤与睡眠剥夺、血亏阴虚证候具有相关性。自由基水平增加、全血象减少是老年血亏阴虚型失眠的病理机制之一。反证验方酸枣仁汤可有效改善证候模型大鼠的学习记忆能力及修复脑损伤,其作用机理可能与抗自由基、补血作用有关;4、大脑皮质及下丘脑部位Glu、GABA含量及Glu/GABA比值均升高可能是老年血亏阴虚型失眠的神经生物学病理机制。酸枣仁汤治疗老年血亏阴虚型失眠的作用机制可能与通过下调大脑皮质及下丘脑部位Glu、GABA的含量及Glu/GABA的比值来保护脑组织有关。5、睡眠剥夺可明显上调大鼠脑内皮质及海马部位GABAARa1和γ2亚单位表达。酸枣仁汤治疗老年血亏阴虚型失眠的作用机制可能与下调大鼠大脑皮质及海马部位GABAARa1和γ2亚单位的表达有关。6、睡眠剥夺可上调大鼠大脑皮质部位星形胶质细胞标志物—胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达,提示星形胶质细胞为可兴奋细胞,且参与睡眠调节。大脑皮质部位GFAP的表达明显增强可能是老年血亏阴虚型失眠的又一病理机制。酸枣仁汤治疗老年血亏阴虚型失眠的作用机制可能还与下调大脑皮质部位GFAP的表达有关。