论文摘要
溶菌酶（lysozyme，LYZ）是一种专门作用于微生物细胞壁的水解细菌细胞壁中粘多糖β-1，4-糖苷键的胞壁质酶，是一种碱性蛋白质，存在于许多动物、植物和微生物中。研究发现，溶菌酶对革兰氏阳性细菌具有直接的溶解作用，催化革兰氏阳性菌细胞壁不溶性多糖水解，生成可溶性黏肽。在分泌型免疫球蛋白A和补体的参与下，溶菌酶还对革兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用，是一种天然的抗菌物质。由于其能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬和消化功能、将诱发炎症的酸性物质灭活、增强抗菌素及其它药物的疗效，具有消炎消肿、帮助组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用，因此溶菌酶在医疗界中倍受关注。近年来，随着生物学技术和免疫学技术的发展，对溶菌酶的研究取得了令人瞩目的成就。利用DNA重组技术发展溶菌酶的抗菌效果，已成为其中重要的研究方向。牛体内溶菌酶（bovine lysozyme，bLys）有大约10种，表达的潜在位点有：乳腺、唾液、泪液、胃、气管组织以及中性粒细胞、嗜红细胞、巨噬细胞、白细胞等。由于牛奶与人们的生活息息相关，其质量的好坏关系着人们的健康，因此，对牛奶溶菌酶的研究尤为突出。为构建具有高效抗菌、活性持久的抗菌基因，探索研制新型抗菌制剂，克服耐药性细菌感染日益严重的问题，本实验构建了原核表达载体pGEX-4T-1-Lys（pGL）。本实验是以成功构建的新型牛溶菌酶基因原核表达载体pGL为模板，用PCR扩增得到目的片段Lys基因，将VR1020和目的片段Lys分别用BamHI和BglⅡ双酶切，并将VR1020酶切片段先进行去磷酸化，然后将两种酶切产物在16℃水浴过夜连接；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组子，用碱裂解法小规模提取重组子质粒DNA，用BamHI，BglⅡ作双酶切鉴定验证，并作质粒PCR鉴定。经双酶切和质粒PCR的实验结果初步确定的阳性重组子进行双向基因测序，测序结果证明插入目的片段正确，证实新型牛溶菌酶基因已经克隆到真核表达载体VR1020（VR1020-Lys，命名为VRL）上。将重组质粒VRL以JetPEITM Cationic polymer分子包裹，介导转染真核HEK293细胞，转染培养24h、48h、72h后分别提取培养细胞mRNA进行RT-PCR，与VR1020转染细胞比较发现，转染后24h、48h和72h的HEK293细胞的RNA中含有与目的cDNA片段对应的mRNA。为了探索一种更经济高效的转染介质，本实验同时还制备了壳聚糖纳米颗粒（chitosan nanoparticles，CNP），用此壳聚糖纳米颗粒包裹重组质粒VRL后转染HEK293细胞，转染的HEK293细胞中也表达与目的cDNA片段对应的mRNA，说明了壳聚糖纳米颗粒也能作为一种有效的转染介质。用转染后HEK293细胞上清分别作抑制标准大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎球菌生长实验，实验结果证明新构建的真核表达质粒VRL具有良好的抑制革兰氏阳性菌生长的效果，这些为深入开展VRL在动物体内的抗感染抑菌实验奠定了可靠的基础。