苔藓细胞色素P450及小G蛋白PpRan基因的克隆及分析

论文摘要

苔藓(P. patens)是目前发现的唯一具有高频率同源重组特性的植物。基因打靶技术的核心是同源重组,由于结果的可预见性和准确性,基因打靶已成为功能基因组学研究的常规技术。苔藓(P. patens)生命周期短,易于培养,而且其个体小,易于转化(PEG介导的原生质体转化),再生力极强,有利于高通量规模化培养和突变体筛选。苔藓植物也有世代交替,但其单倍体的配子体世代占优势,这利于快速构建突变体和遗传性状的直接分析。因此,苔藓在整个植物功能基因组学研究中具有代表性。本研究以苔藓(P. patens)为模式系统,对苔藓细胞色素P450和小G蛋白PpRan基因进行了相关研究。细胞色素P450是一类具有混合功能且含血红素的氧化还原酶。植物细胞色素P450参与多种代谢途径,包括参与植物体的基础代谢和植物次生代谢,植物P450基因功能研究一直倍受国内外科学家重视。本研究克隆了苔藓的4个细胞色素P450基因,利用同源重组技术对这4个P450基因实施定点突变,成功构建了诱导其功能缺失的载体;同时我们将利用P450promoter::cDNA::GFP融合技术研究细胞色素P450的亚细胞定位。根据得到的细胞色素P450基因功能缺失突变体的表型变化及细胞色素P450的亚细胞定位结果来研究P450基因的功能。本研究成功构建了这4个P450基因的功能缺失载体并转化苔藓,已得到CYP73A49基因缺失的苔藓,目前还没有观察到明显的表型变化,需要进一步进行生理生化方面的研究。P450promoter::cDNA::GFP融合蛋白载体的亚细胞定位的研究正在进行中。Ran是一种大量分布于细胞核内的小分子的GTP酶,在核质运输过程中具有十分重要的作用,而且还参与调控细胞分裂及其信号传导的功能。本研究利用基于同源序列的PCR技术,成功克隆了PpRan基因组序列及cDNA序列,并对苔藓PpRan基因编码的氨基酸保守序列进行了相关分析。利用半定量PCR技术对PpRan基因在苔藓不同组织中以及苔藓受到缺磷胁迫时的表达研究发现:PpRan基因的表达具有组织特异性,茎叶体和原丝体中表达量较高,假根中表达量比较低;PpRan基因受缺磷胁迫诱导表达,随着缺磷胁迫时间的延长表达量越来越高。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 苔藓（P. patens）—植物代谢与发育研究的理想模式系统
• 1.1.1 引言
• 1.1.2 生命周期
• 1.1.3 代谢研究
• 1.1.4 发育研究（激素的合成与作用）
• 1.1.5 小结与展望
• 1.2 细胞色素 P450 研究简介
• 1.2.1 引言
• 1.2.2 细胞色素P450的生化特征
• 1.2.3 细胞色素P450 参与苯丙烷类物质代谢途径
• 1.2.4 细胞色素P450 基因参与植物生长素的合成
• 1.2.5 细胞色素P450 基因参与芥子油甙代谢
• 1.2.6 前景与展望
• 1.3 低分子量G 蛋白Ran 研究概况
• 1.3.1 引言
• 1.3.2 低分子量GTP 结合蛋白
• 1.3.3 低分子量GTP 结合蛋白Ran 功能的研究
• 1.3.4 问题与展望
• 2 苔藓细胞色素P450 基因的克隆与分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 细胞色素P450 cDNA 编码序列的克隆与分析
• 2.2.2 细胞色素P450基因组DNA的克隆与分析
• 2.2.3 P450promoter::cDNA::GFP 融合蛋白载体的酶切鉴定
• 2.2.4 潮霉素（hpt）筛选标记的克隆
• 2.2.5 细胞色素P450功能缺失载体的PCR及酶切鉴定
• 2.2.6 PEG介导的苔藓原生质体转化结果鉴定
• 2.3 讨论
• 3 苔藓PpRan 基因的克隆与表达研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料与试剂
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 苔藓PpRan基因组DNA及cDNA的克隆及分析
• 3.2.2 苔藓PpRan 基因的组织表达特异性分析
• 3.2.3 苔藓受缺磷胁迫时PpRan 基因的表达特性分析
• 3.3 讨论
• 4 结论和后续工作
• 4.1 结论
• 4.2 后续工作
• 参考文献
• 附录
• 缩写表
• 致谢
• 攻读学位期间科研成果