O型口蹄疫病毒VP1重组蛋白的表达及其免疫原性的研究

论文摘要

口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是偶蹄动物共患的一种急性,热性,高度接触性传染病,被国际兽疫局（OIE）列为A类疾病。口蹄疫传播迅速,给各国的带来了经济上和政治上很大的经济损失。我国目前通过接种灭活苗疫苗的方法来控制该病的流行,灭活疫苗虽然具有完整的免疫原性和良好的保护效果,但存在病毒灭活不彻底甚至活毒逃逸等不安全因素。随着基因工程技术的发展,多种新型疫苗因为安全可靠,容易进行质量控制等优点吸引了更多研究人员的注意。其中,重组蛋白疫苗只含有完整病毒的有效的免疫结构,在刺激保护免疫的同时还保证了安全性,同时其生产制备手段已非常成熟,生产成本低廉,因而是兽用疫苗的最佳发展方向。口蹄疫的病原为口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）,口蹄疫病毒共有7种血清型:A,O,C,Asia1,SAT1,SAT2和SAT3,型内又分若干亚型。口蹄疫病毒衣壳由4种蛋白即VP1,VP2,VP3和VP4各60个拷贝组成,其中VP1,VP2和VP3组成衣壳蛋白亚单位,VP4位于病毒颗粒内部。VP1蛋白是FMDV主要的抗原,它含有的G-H环包含B细胞抗原表位141-160aa及200-213aa,是诱导机体产生中和抗体的免疫表位,可以诱导产生保护性免疫应答,因此是研究口蹄疫疫苗的理想抗原。本实验选取FMDV O/TAW/97株结构蛋白VP1上141-160aa及200-213aa的序列,合成两拷贝141-160aa-200-213aa串联片段（2VP1）,通过PCR扩增另两拷贝的片段,构建含四拷贝141-160aa-200-213aa串联片段（4VP1）的原核表达载体pET32a-4VP1,理想的疫苗不仅应包含B细胞表位还应包含T细胞表位,因为此表位片段仅含有B细胞表位,缺少T细胞表位,不能刺激机体产生T细胞免疫应答,因此本实验选取合成了含乙肝表面抗原（HBsAg）和破伤风类毒素（Tr）的串联片段的T细胞表位,并且插入了4VP1和2VP1的N端,克隆至原核表达载体pET32a（+）,构建融合型表达载体pET32a-TCE-4VP1及pET32a-TCE-2VP1 ,将构建好的三个表达质粒pET32a-4VP1、pET32a-TCE-4VP1及pET32a-TCE-2VP1转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,选择最适的诱导条件。结果表明,构建的三种表达载体经过酶切鉴定和测序,证实其插入的片断大小、读码框架正确。所表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子量分别约为38.5kDa、43.5kDa和34.6kDa,重组菌体在LB中经37℃、0.1mM IPTG、诱导4h即可使目的蛋白达到最大量诱导,重组菌经超声波破碎后,经SDS-PAGE显示部分在上清中表达,部分以包涵体形式表达,上清和包涵体复性后经通过镍亲和层析得到纯化的融合蛋白4VP1、TCE-4VP1及TCE-2VP1,经Western-blotting鉴定融合蛋白具有良好的免疫学活性,为研究重组蛋白的免疫原性奠定了基础。本实验选取常用O型口蹄疫灭活苗免疫ICR小鼠,制备阳性血清,共免疫3次,每次间隔2周。阴阳性血清用于建立ELISA方法,并且以小鼠的阳性血清作为一抗用于表达蛋白的Western-blotting分析。以人工合成O/FMDV/TAIWAN97株结构蛋白VP1上141-160aa的20肽作为包被原,确定了包被96孔ELISA板的最佳浓度为5μg/mL,10%FCS、37℃封闭2h,被检测血清的最佳稀释度为1:200,一抗反应时间为37℃、1h,二抗反应时间为37℃、45min,选用TMB为底物,显色时间为15min,用2M H2SO4为终止液,为检测血清中抗重组蛋白的抗体奠定了基础。利用纯化的3种融合蛋白以100μg/只免疫16-22g清洁级小鼠,并免疫一组表达TCE-2VP1的重组菌体,以常用O型FMDV灭活苗作为阳性对照,PBS作为阴性对照。,共免疫三次,每次间隔2周,每次免疫前采血,用建立的间接ELISA方法检测3次免疫后2周的小鼠血清中抗20肽抗体,被检血清1:100倍稀释之后做倍比稀释,结果表明三种融合蛋白均能刺激小鼠产生较高的抗20肽抗体。在三免后两周,测定免疫小鼠血清中细胞因子IFN-γ和IL-4的含量,结果表明免疫重组蛋白TCE-4VP1组产生的IFN-γ含量最高,其次为4VP1组和TCE-2VP1组。说明随着抗原表位的拷贝数增多和添加T细胞表位,小鼠体内分泌抗体和细胞因子的能力也会提高。此项研究也为研制口蹄疫基因重组疫苗奠定基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一篇 文献综述
• 一 口蹄疫研究进展
• 1 口蹄疫病原学
• 2 口蹄疫诊断技术研究进展
• 二 口蹄疫疫苗研究进展
• 参考文献
• 研究一 FMDV VP1 重组蛋白的原核表达、纯化和鉴定
• 1 材料及方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 附：载体构建流程图
• 研究二 重组蛋白对小鼠特异性免疫的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢