抗埃博拉病毒和马尔堡病毒核蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定

论文摘要

本研究分别将埃博拉病毒（EBOV）和马尔堡病毒（MARV）核蛋白（NP）基因（enp、mnp）克隆入原核载体pET-32a（+）中，同时将链球菌抗生物素标签（sbp）引入mnp 3’端并克隆到原核载体pET-20b（+）中。经酶切鉴定和序列测定，重组质粒pET-32a（+）-enp、pET-32a（+）-mnp和pET-20b（+）-ms构建成功，然后将重组质粒分别转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。SDS-PAGE分析显示，表达的重组蛋白EBOV-NP-Trx-His（ETH）、MARV-NP-Trx-His（MTH）和MARV-NP-SBP（MS）分子量分别为116 kDa、108 kDa、98 kDa。经Western blot分析表明，抗His标签单抗与重组蛋白ETH和MTH上的His标签均能发生特异性反应，抗MARV-NP（MNP）单抗可与MTH和MS发生特异性反应，说明重组蛋白ETH、MTH和MS都成功表达，且MTH和MS与抗MNP单抗具有良好的免疫反应性。分别以重组ETH和MTH为抗原免疫BALB／c小鼠，3次加强免疫后经细胞融合、间接ELISA法双筛选和3次有限稀释法连续克隆后，最终获得3株抗ENP的特异性杂交瘤细胞（3G8、4B4、4C12）和3株针对MNP的杂交瘤细胞（1H4、2G1、3B5）。除单抗3G8的亚类为IgG2aκ外，其它的皆为IgG1κ。3G8、4B4、4C12、1H4、2G1、3B5细胞培养液上清和腹水的ELISA效价分别为1：2．560×103、1：2．560×103、1：2．560×103、1：6．400×103、1：6．400×103、1：1．280×104和1：1．638×107、1：8．192×106、1：8．192×106、1：1．024×106、1：4．096×106、1：8．192×106。Western blot分析表明，抗ENP的3株单抗与MTH无交叉反应性，抗MNP的3株单抗则与ETH无交叉反应性，且6株单抗与His标签和Trx标签都无反应，说明这6株单抗均具有良好的特异性。经辛酸-硫酸铵法纯化后，获得的单抗3G8、4B4、4C12、1H4、2G1、3B5的浓度分别为4．584 mg／mL、4．822 mg／mL、10．000 mg／mL、0．713 mg／mL、1．166 mg/mL、3．702 mg／mL。亲和力实验表明，单抗3G8、4B4、4C12与ETH的亲和力常数（Kaff）分别为2．023×109L/mol、1．633×109L／mol、1．607×109L／mol；单抗1H4、2G1、3B5与MTH的Kaff分别为1．100×109L／mol、1．235×109L／mol、1．408×109L／mol。指数相加实验结果表明，抗ENP单抗4B4与4C12识别相同的抗原表位，3G8与4B4或4C12识别的抗原表位则不相关；抗MNP单抗1H4、2G1、385识别相同的抗原表位。这些特异性单抗的成功制备分别为EBOV和MARV的诊断奠定了物质基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 1 前言
• 1.1 病原学特性
• 1.1.1 病毒形态和结构
• 1.1.2 分子生物学特征
• 1.1.3 生物学特性
• 1.2 流行病学
• 1.2.1 病毒自然宿主及传播途径
• 1.2.2 流行特征
• 1.2.3 流行概况
• 1.3 临床症状与病理改变
• 1.3.1 临床症状
• 1.3.2 病理变化
• 1.4 实验室检验
• 1.4.1 电镜检查
• 1.4.2 病毒分离
• 1.4.3 核酸检测
• 1.4.4 血清学诊断
• 1.4.5 抗原检测
• 1.5 防治
• 1.5.1 治疗
• 1.5.2 疫苗
• 1.6 重组蛋白和单克隆抗体在EBOV和MARV方面的应用
• 1.7 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 主要仪器和耗材
• 2.1.2 菌株、质粒及单抗
• 2.1.3 动物与细胞
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要试剂溶液的配制
• 2.1.5.1 培养基及相关试剂
• 2.1.5.2 琼脂糖凝胶电泳相关试剂
• 2.1.5.3 蛋白纯化缓冲液
• 2.1.5.4 Tris-cine系统电泳缓冲液
• 2.1.5.5 Western Blot相关溶液
• 2.1.5.6 ELISA主要试剂
• 2.1.5.7 单抗制备主要试剂
• 2.1.5.8 单抗纯化主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 enp、mnp和ms基因克隆及重组质粒构建
• 2.2.1.1 引物设计及合成
• 2.2.1.2 enp、mnp和ms基因的扩增
• 2.2.1.2.1 enp、mnp基因的扩增
• 2.2.1.2.2 ms融合基因的扩增
• 2.2.1.3 重组质粒的构建及鉴定
• 2.2.1.3.1 重组质粒的构建
• 2.2.1.3.2 重组质粒的酶切验证
• 2.2.1.3.3 阳性重组子的保存
• 2.2.1.3.4 enp、mnp和ms基因序列测定
• 2.2.2 重组蛋白ETH、MTH和MS的诱导表达及鉴定
• 2.2.3 重组蛋白的纯化
• 2.2.3.1 重组蛋白ETH和MTH的纯化
• 2.2.3.2 重组蛋白MS的纯化
• 2.2.3.3 蛋白浓缩
• 2.2.4 动物免疫
• 2.2.5 重组蛋白ELISA工作条件的优化
• 2.2.5.1 免疫BALB/c小鼠血清的采集和制备
• 2.2.5.2 重组蛋白ELISA工作条件的优化
• 2.2.6 杂交瘤细胞株的建立
• 2.2.6.1 Sp2/0细胞的复苏与传代培养
• 2.2.6.2 饲养细胞的制备
• 2.2.6.3 骨髓瘤细胞的制备
• 2.2.6.4 免疫脾细胞的制备
• 2.2.6.5 细胞融合
• 2.2.6.6 融合细胞的培养
• 2.2.6.7 阳性孔的克隆
• 2.2.6.8 杂交瘤细胞的冻存和复苏
• 2.2.7 单抗腹水的生产
• 2.2.8 单抗的纯化
• 2.2.9 单克隆抗体特性的鉴定
• 2.2.9.1 细胞培养上清和腹水效价的测定
• 2.2.9.2 单克隆抗体的亚型鉴定
• 2.2.9.3 单抗的特异性鉴定
• 2.2.9.4 单抗的亲和力鉴定
• 2.2.9.5 单抗的表位分析
• 3 结果与分析
• 3.1 基因克隆及重组质粒
• 3.1.1 enp、mnp和ms基因的扩增产物
• 3.1.2 pET-32a（+）-enp、pET-32a（+）-mnp和pET-20b（+）-ms重组质粒的构建及鉴定
• 3.2 重组蛋白ETH、MTH和MS的诱导表达
• 3.3 大量制备重组蛋白ETH、MTH和MS
• 3.4 重组蛋白ELISA条件的优化
• 3.5 单抗的筛选及杂交瘤细胞株
• 3.6 细胞培养上清及腹水的效价
• 3.7 单抗Ig亚类
• 3.8 单抗的特异性
• 3.9 大量制备和纯化单抗
• 3.10 单抗相对亲和力
• 3.11 单抗识别的抗原表位初步分析
• 4 讨论
• 4.1 蛋白的表达纯化
• 4.2 动物免疫效果
• 4.3 筛选方法
• 4.4 细胞融合
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的学术论文
• 致谢