单增李斯特氏菌液相核酸探针检测方法的建立与初步应用

论文摘要

李斯特氏菌（Listeria）在自然界分布广泛,可来源与土壤、水、植物和反刍动物、人的粪便,极易污染各类食品。该属中的单核细胞增生性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes,以下简称单增李斯特氏菌）主要侵袭孕妇、新生儿、免疫功能低下成人,特别是老年人,更可导致人和动物患脑膜炎、败血症、流产等,病死率高达30%～70%,是目前最重要的人类食源性病原菌之一。国内外对单增李斯特氏菌均给以高度重视,WHO将其列为21世纪对中国人卫生健康具有重大影响的12种病原微生物之一,并建立了单增李斯特氏菌食源性疾病报告系统。传统单增李斯特氏菌检测方法,主要是常规增菌培养后在进行生化鉴定,检测过程耗时4～10天,费时费力,难以适应快速检验的要求。免疫法比较快,但单克隆抗体制备比较困难,易产生交叉反应,特异性差。而PCR方法快速特异,灵敏度很高,但由于死菌中的DNA降解较慢,也容易产生假阳性。前增菌可以部分减少PCR检测时出现的假阳性,但增加分析时间,且当死菌含量增多时,用PCR结合探针仍可以检测到假阳性信号。因此,研究一套高效可行的检测方法显得十分必要。本实验主要应用新近发展起来的基因探针方法快速检测食品中单增李斯特氏菌,简化了检验流程、提高检测效率,并探讨了其在禽肉类样品检测中的应用。选择单增李斯特氏菌同源性较高的致病基因hlyA,利用Primer 5.0,Oligo 6和Laseigene等软件设计核酸探针,探针大小21bp,具有寡核苷酸探针的优点。此方法利用化学发光物质吖啶酯标记寡核苷酸探针,所设计的探针能够与目的核苷酸片段杂交,形成DNA-RNA杂交体,杂交后无需分离步骤,利用差分水解（Differential hydrolysis）鉴别,即先加入弱碱性溶液,未经杂交的发光探针失去发光特性（半衰期小于1min）,而与靶细胞杂交的探针可以保护吖啶酯不在碱性环境下水解。由于吖啶酯平面结构镶嵌于杂交体双螺旋的内部,受到空间位阻的保护,水解速度缓慢（半衰期10min以上）,仍有发光性能,再加入碱性H2O2进行检测时,能够再发光仪上检测到发光,整个试验过程只需要30分钟。此方法称为核酸杂交保护分析,目前在我国还很少应用。取单增李斯特氏菌标准株的纯培养菌进行核酸杂交保护分析的试验,通过条件的筛选和优化,此方法能够特异性的检测出单增李斯特氏菌,而对绵羊李斯特氏菌,空肠/结肠弯曲菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌、绿脓假单胞菌等非单增性李斯特氏菌均检测为阴性结果。挑取不同个数的阳性菌落进行敏感性试验,最低检测限度为2个阳性菌落（10cfu/mL）。将建立的液相核酸杂交保护分析方法应用于送检的100份鸡肉样品的检测,在分离培养的过程中,对纯培养菌落进行核酸杂交保护分析检测,并与常规生化鉴定结果对比,核酸杂交保护分析检测阳性率为15%（15/100）,生化鉴定检出率为15%（15/100）。应用结果显示,本研究所建立的液相核酸探针检测单增李斯特氏菌的方法具有简便、快速、准确、可靠的优势,有广泛的应用价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 一.单核细胞增生性李斯特氏菌
• 二.李斯特氏菌的检测
• 三.单核细胞增生性李斯特氏菌的检测方法及研究进展
• 四.核酸探针
• 五.化学发光标记
• 第二章 实验部分
• 1.材料与方法
• 1.1 供试菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 1.5 液相核酸探针检测方法的建立
• 1.6 送检鸡肉样品的分离培养与鉴定
• 2.结果
• 2.1 液相核酸探针检测条件优化的结果
• 2.2 送检鸡肉样品的鉴定结果
• 3.讨论
• 3.1 液相核酸探针检测方法及结果的讨论
• 3.2 应用前景
• 第三章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介