干预β-淀粉样前体蛋白裂解酶基因减少神经细胞β淀粉样蛋白的产生

论文摘要

研究背景随着人类平均寿命的不断延长,阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）越来越成为影响老年人生活的一大疾病。在国外阿尔茨海默病是导致老年人智能损害的最常见原因,超过65岁的人群中有大约5-10%的人患有阿尔茨海默病,而85岁以上的老年人有超过一半的人患有阿尔茨海默病。在国内,我们一度认为血管性痴呆的发病率高于AD,但是最近几年的流行病学调查显示,AD在我国的发病率也处于各种痴呆的第一位。阿尔茨海默病是一种中枢神经系统退行性变性疾病。患者由于神经细胞的大量死亡而逐渐出现记忆能力、语言能力和直觉能力的全面下降,最终会因脑衰竭而死亡。阿尔茨海默病最具有特异性的病理特征的是老年斑、神经纤维缠结,以及神经突触和神经细胞的丢失。而脑组织内老年斑的形成是造成阿尔茨海默病的主要原因,而且在阿尔茨海默病的早期出现。老年斑的主要成分是39-43氨基酸长的β淀粉样肽（β-amyloid peptide,Aβ）,Aβ由β淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein,APP）水解而来,APP可以被三种水解酶裂解:α-secretase、β-secretase、γ-secretase。α-secretase的水解位点在APP跨膜区的Aβ区内,产生一长的可溶性的胞外结构α-APPs和一83碱基的C末端（COOH-terminal fragment,CTF）——C83,不产生Aβ。而淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）经β淀粉样前体蛋白裂解酶（β-siteAPP cleaving enzyme,BACE1）和γ-分泌酶裂解产生Aβ。淀粉级联学说认为老年斑的核心成分β-淀粉样肽（β-amyloid peptide,Aβ）是AD发生的主要原因。BACE1（β-secretase）酶是Aβ形成的关键酶。老年斑或Aβ可以促进AD的疾病进展,而且是AD临床表现的关键性因素。Aβ具有神经毒性作用,当Aβ在脑组织中沉积超过一定的时间后,就可以造成神经细胞的死亡、脑内的炎症性反应、以及其他的可以促进AD病情进展的有害的病理改变。而且,大量的研究显示,Aβ在AD患者疾病的早期即出现。小干扰RNA（siRNA）可谓是引起生物科学研究领域一场变革的工具,siRNA是一种特异性抑制特定基因的有力手段。RNAi不但可以用来快速的判断基因的功能,而且目前已经在病毒感染、肿瘤和遗传性疾病中进行了大量的研究,并取得了良好的效果。减少Aβ的生成成为治疗AD的主要靶位点。目前唯一得到FAD许可的治疗药物只有乙酰胆碱酯酶抑制剂（如tacrine,donepezil,rivastigmine,galantamine）,而其他的药物治疗正在研究进行中,这些包括:单胺氧化酶抑制剂（如selegiline）,抗氧化剂（如VitE、C）,雌激素替代疗法和抗炎制剂（如非甾体类抗炎药物）,大多数的治疗均为姑息性治疗,而非预防或治愈性手段。目前减少Aβ产生的有许多方法,在本实验中我们选择了抑制BACE1基因作为研究的靶基因,通过抑制此该基因的表达来减少Aβ的生成。我们利用干扰技术应用siRNA对BACE1基因进行干扰抑制,观察BACEl基因在SK-N-SH细胞株中的表达的改变,以及Aβ产生的改变情况。研究目的1、利用siRNA干扰技术,采用化学合成的siRNA干扰或封闭BACE1基因,观察BACE1的表达改变。2、进一步观察BACE1基因的表达下降后,对体外培养的神经细胞Aβ产生的影响。实验方法1、人类的神经母细胞瘤细胞SK-N-SH细胞正常情况下,表达APP和BACE1,我们利用SK-N-SH细胞作为体外研究的细胞系。2、我们利用Ambion公司的Silencer? pre-designed siRAN Specificationsystem设计合成了3对BACEl基因双链siRNA。3对siRNAs特异性的针对BACE1基因。3、利用Ambion公司的siPORT NeoFX转染试剂转染siRNA入SK-N-SH细胞。为比较、观察siRNA对BACE1基因的干扰作用,分别使用了10μM-50uM浓度不等的siRNA转染SK-N-SH细胞,并且分别从12-48小时搜集细胞,进行检测。4、应用RT-PCR在的mRNA水平上检测BACE1基因的表达。5、应用Western blot方法,检测转染48小时后的神经细胞的BACE1蛋白表达。6、应用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测分泌到细胞外的Aβ42的量。转染后6小时将siPORT NeoFX转染试剂换成MEM细胞培养液继续培养SK-N-SH细胞,并且每6-12小时收集培养液上清用于检测Aβ42。结果1、设计合成特异性的siRNAs我们利用Ambion公司的Silencer? pre-designed siRAN Specification system设计合成了3对BACE1基因双链siRNA。3对siRNAs特异性的针对BACE1基因。2、siRNA转染SK-N-SH细胞株传代细胞:通过对3对siRNA1、siRNA2、siRNA3从不同的工作浓度和不同的转染后时间进行了观察,我们发现40nM和50nM时转染效率比较高,而且siRNA1和siRNA2对BACE1基因的抑制效应比较好。36小时和48小时的时间点siRNA的封闭效果比较好。3、RT-PCR结果:经过对同一标本的β-actin的产物积分光密度校正目的基因的积分光密度值,并按公式相对值=目的基因表达强度/β-actin表达强度,计算出目的基因表达的相对值,我们可以看出siRNA对BACE1基因的封闭效应达到了50%以上,实验组SK-N-SH细胞的基因抑制效果与对照组比较,具有统计学的显著性差异。4、Western blot杂交结果:利用NIH成像系统对Western blot成像的信号强度进行量化分析,并与β-actin相比较,β-secretase酶的表达有明显的下降,与对照组比较有显著性差异。5、ELISA方法检测结果:ELISA检测显示,处理以siRNA1、siRNA2的SK-N-SH细胞分泌到细胞外的Aβ42较对照组有明显的减少。但是siRNA3干扰组的细胞所产生的Aβ42虽然也有减少,但是与对照组比较无显著性差异。结论1,利用siRNA干扰技术可以有效地干预神经细胞内源性的BACE1表达下降,此种抑制作用表现在mRNA和蛋白水平。2、SK-N-SH细胞内的BACE1基因表达的降低,直接导致了细胞产生并分泌到细胞外Aβ42减少。改变BACE1基因的表达,可以有效的抑制Ap42的产生,BACE1基因可以作为AD治疗的靶基因。意义Aβ的过度生成以及在神经细胞内的沉积,是AD患者脑内的特征性的病理改变,也是促进AD疾病发展的关键因素。因此本研究的意义所在:siRNA可以在体外可以干预BACE1表达,β-secretase酶的活性的降低致使AB减少。为我们今后AD针对β-secretase酶和Aβ治疗的治疗靶点,提供了有力的理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略语中英文对照
• 第一部分:运用RNA干扰技术抑制β-淀粉样前体蛋白裂解酶活性
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 第一部分小结
• 参考文献
• 第二部分:体外抑制BACE1（β-secretase）表达减少神经细胞Aβ的产生
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附表
• 附图
• 讨论
• 参考文献
• 总结
• 致谢
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