花椒再生体系的建立及ipt基因遗传转化研究

论文摘要

本研究以朝仓花椒为研究对象,建立组培再生体系,并在此基础上,首次利用农杆菌介导法将细胞分裂素生物合成限速酶—异戊烯基转移酶基因（ipt）导入花椒体内,探索花椒遗传转化的技术参数,初步建立了花椒遗传转化体系,为利用基因工程技术对花椒进行遗传改良打下基础。其主要研究内容如下:1花椒再生体系建立试验以花椒萌发生长5-20d的无菌苗叶柄、茎段及叶片为外植体,研究在以WPM培养基为基本培养基中附加不同的浓度的细胞分裂素（6-BA）和生长素（NAA、IBA）,对朝仓花椒愈伤组织诱导及再生的影响,建立了朝仓花椒植株再生体系。结果表明:愈伤组织诱导及分化最适培养基为WPM+6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1,最适生根培养基为1/2WPM不添加任何激素,移栽时,以珍珠岩和田土1∶3比例成活率最高,28d后统计成活率可达85.6%。2农杆菌介导的朝仓花椒遗传转化体系建立建立了以朝仓花椒叶柄及茎段为转化受体的根癌农杆菌遗传转化体系,初步确定了抗生素卡那霉素（kan）的筛选浓度,在遗传转化过程中,详细探讨了外植体预培养时间、浸染菌液浓度、浸染时间、共培养时间等影响因素对转化效率的影响。结果表明:外植体预培养3d,菌液浓度在OD值0.5-0.7,浸染10min,共培养3d为最佳技术参数;延迟7d筛选可提高转化效率,重悬液及共培养基中添加100μmol·L-1AS可提高转化率至24.6%。3转化植株检测通过农杆菌介导法遗传转化朝仓花椒,并对转化植株进行GUS组织活性及PCR检测。结果表明部分转化植株GUS染色显蓝色,部分植株PCR检测呈阳性,初步证实目的基因已转入花椒基因组中。ipt基因表达有效促进了朝仓花椒遗传转化过程中不定芽的诱导,转ipt基因花椒能产生大量分枝,易于增殖培养,但转基因植株生根受到抑制。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 木本植物基因工程研究进展
• 1.1 植物转基因概述
• 1.2 木本植物遗传转化特点
• 1.3 目的基因
• 1.3.1 抗性基因
• 1.3.2 品质改良
• 1.4 木本植物遗传转化方法
• 1.4.1 受伤植物器官直接感染
• 1.4.2 整体植株接种共感染
• 1.4.3 原生质体转化
• 1.4.4 体细胞或胚细胞的转化
• 1.4.5 附体腋芽直接感染
• 1.5 木本植物遗传转化影响因素
• 2 花椒研究进展
• 2.1 国内研究进展
• 2.1.1 花椒育种学研究
• 2.1.2 花椒育苗技术
• 2.1.3 花椒组织培养研究
• 2.1.4 花椒栽培学研究
• 2.1.5 花椒加工利用
• 2.1.6 花椒药理作用
• 2.2 国外研究现状
• 2.3 花椒研究发展趋势
• 3 植物转ipt基因研究进展
• 第一章 花椒再生体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 材料的预处理
• 1.2.2 培养基
• 1.2.3 培养条件
• 1.2.4 培养过程
• 2 结果与分析
• 2.1 诱导培养
• 2.1.1 最佳取材时期及消毒时间确定
• 2.1.2 无菌苗生长情况
• 2.2 愈伤组织诱导及分化
• 2.2.1 不同培养基对花椒愈伤组织诱导的影响
• 2.2.2 不同激素配比对花椒叶片愈伤组织诱导及分化的影响
• 2.2.3 不同激素配比对花椒叶柄愈伤组织诱导及分化的影响
• 2.2.4 不同激素配比对花椒茎段愈伤组织诱导及分化的影响
• 2.3 茎段不定芽再生方式
• 2.4 生根及移栽
• 3 讨论
• 3.1 取材
• 3.2 外植体种类
• 3.3 激素对花椒再生的影响
• 3.4 生根培养
• 第二章 农杆菌介导的花椒遗传转化研究
• 前言
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 农杆菌菌株及质粒
• 1.3 主要生物化学试剂
• 1.4 主要仪器
• 1.5 常用培养基
• 1.5.1 细菌培养基
• 1.5.2 植物培养基:
• 1.6 常用溶液
• 2 实验方法
• 2.1 材料的准备
• 2.2 根癌农杆菌的培养
• 2.3 遗传转化步骤
• 2.4 卡那霉素（Kan）有效选择压的确定
• 2.5 不同因素对遗传转化影响
• 2.5.1 预培养时间
• 2.5.2 农杆菌菌液浓度
• 2.5.3 浸染时间
• 2.5.4 共培养时间
• 2.5.5 添加乙酰丁香酮（AS）对遗传转化影响
• 2.5.6 延迟筛选
• 2.6 GUS报告基因活性的检测
• 2.7 转基因植株的PCR检测
• 2.7.1 植物基因组DNA的提取（CTAB法）
• 2.7.2 质粒DNA提取（小量快速抽提）
• 2.7.3 引物设计及PCR扩增程序
• 3 结果与分析
• 3.1 卡那霉素（Kan）有效选择压的确定
• 3.2 菌液浓度对转化的影响
• 3.3 不同因素对遗传转化影响
• 3.3.1 预培养时间对花椒遗传转化的影响
• 3.3.2 浸染时间对花椒遗传转化的影响
• 3.3.3 共培养时间
• 3.3.4 添加AS对花椒遗传转化的影响
• 3.3.5 延迟筛选对遗传转化的影响
• 3.4 转ipt基因对抗性芽诱导和转化植株生根的影响
• 3.5 转基因植株的GUS活性检测
• 3.6 转基因植株PCR分子检测
• 4 讨论
• 4.1 影响花椒遗传转化效率的因素
• 4.1.1 农杆菌与共培养问题
• 4.1.2 延迟筛选对遗传转化的影响
• 4.2 ipt基因表达对转化植株的影响
• 致谢
• 参考文献
• 附录